Дипломная работа: Антипролиферативное действие карнозина и его производных на опухолевые клетки нейрального происхождения

Заключение I: Ингибирующее действие карнозина на пролиферацию клеток феохромоцитомы крысы РС-12 сопровождалось модификацией клеточного цикла и накоплением клеток в S и G₂/М фазах. Метилирование карнозина приводило к усилению формирования G₂-блока, а ацетилирование молекулы этот эффект ослабляло. L-гистидин-в-аланин (т.н. “карнозин наоборот”) демонстрировал в 5 раз большую эффективность по сравнению с карнозином, однако обладал сильным цитотоксическим эффектом. Синтетический трипептид пениалон также демонстрировал антиоксидантные свойства и индуцировал накопление клеток в S и G₂/М фазах. Однако концентрации пинеалона были на несколько порядков ниже, чем для карнозина. Поскольку изменениям в прогрессии клеточного цикла под действием карнозина предшествовало снижение внутриклеточного уровня АФК, было предположено, что существует взаимосвязь между антипролиферативным и антиоксидантным эффектами карнозина.

РАЗДЕЛ 3.2 Изучение механизма регуляции клеточного цикла под действием карнозина

Исследования механизма антипролиферативного эффекта карнозина были продолжены с использованием культур опухолевых клеток человека, так как именно они представляют собой первостепенную важность и имеют перспективу применения полученных данных на практике.

3.2.1 Карнозин избирательно ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы

Для изучения характера влияния карнозина на пролиферацию опухолевых клеток человека были выбраны четыре клеточные культуры: карцинома горла и рта (FaDu, Cal27), карцинома молочной железы (MB231), глиобластома (U-118-MG). Клетки всех четырех культур обрабатывали карнозином (40 мМ) и оставляли инкубироваться. Каждые два дня в течение 6 дней клетки подсчитывали и вычисляли время удвоения популяции (Td). Результаты действия карнозина (40 мМ) на пролиферацию исследуемых линий опухолевых клеток представлены на Рис. 3.2.1. Как следует из Рис. 3.2.1. карнозин приводил к увеличению Td всех исследованных клеточных линий. Для интактных клеток Td составляло: 18 ч (FaDu), 16 ч (Cal27), 22 ч (MB231) и 24 ч (U-118-MG). После инкубации с карнозином Td возрастало до: 19 ч (FaDu), 18 ч (Cal27), 26 ч (MB231) и 32 ч (U-118-MG). Увеличение Td под действием карнозина свидетельствовало о замедлении процессов клеточной пролиферации. Наибольшее увеличение Td было отмечено в клетках глиобластомы (Рис. 3.2.1).

Рисунок 3.2.1. Карнозин избирательно ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы. Клетки обрабатывали карнозином (40 мМ) Время удвоения популяций (Td) вычисляли по формуле: Td=0.693t/ln(N_t/N₀), где t - время (дни), N₀ - начальное количество клеток, N_t - количество клеток ко дню t.

Различия в эффективности действия карнозина на опухолевые клетки могут быть связаны с различиями в экспрессии внутриклеточных ферментов, отвечающих за синтез и разрушение карнозина. В организме человека карнозин синтезируется с помощь фермента карнозинсинтетазы из в-аланина и L-гистидина с использованием энергии молекулы АТФ [6, 258]. Гидролиз карнозина на исходные аминокислоты осуществляется в основном с помощью сывороточной карнозиназы [9, 195].

Рисунок 3.2.2. Избирательность действия карнозина сочеталась с различиями в уровнях мРНК карнозин-синтезирующих (А) и карнозин-разрушающих (Б) ферментов в исследуемых клеточных культурах. Результаты ПЦР в реальном времени. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от уровня мРНК в клетках U-118-MG; n=3, p<0.05.

На Рис 3.2.2. представлены результаты измерения экспрессии генов карнозин-синтетазы и карнозиназы в исследуемых клеточных линиях, с помощью метода ПЦР в реальном времени. Из Рис. 3.2.2. видно, что в клетках U-118-MG уровень мРНК карнозин-синтазы был в 3,5 - 5 раз ниже, чем в клетках карцином (Рис. 3.2.2.А), а уровень мРНК карнозиназы, наоборот, был 4 - 6 раз выше (Рис. 3.2.2.Б). На основании этих данных можно предположить, что уровень эндогенного карнозина в клетках глиобластомы изначально ниже, чем в клетках карцином. Изначально низкий уровень карнозина в клетках глиобластомы, вероятно, обуславливает их большую чувствительность к антипролиферативному эффекту карнозина, в то время как высокий уровень карнозина в клетках карцином способствует развитию в них толерантности рост-ингибирующему действию карнозина. Поскольку наиболее выраженный антипролиферативный эффект карнозина был получен на клетках глиобластомы человека U-118-MG, эти клетки были использованы в дальнейших исследованиях.

Для более подробного изучения антипролифативного действия карнозина, клетки U-118-MG инкубировали в среде, в которую добавляли 20-100 мМ карнозина и измеряли Td. На Рис. 3.2.3. представлены результаты подробного анализа влияния карнозина на пролиферацию клеток глиобластомы. Было выяснено, что карнозин приводит к дозо-зависимому увеличению Td клеток U-118-MG, что согласовывалось с полученными ранее данными (Рис. 3.2.1). Td в контроле составляло 35 ч, в присутствии 50 мМ карнозина Td снижалось до 66 ч. Пролиферация была полностью подавлена в пробах обработанных 80 мМ и 100 мМ карнозина (Рис. 3.2.3.А).

Ингибирующий эффект карнозина на пролиферацию клеток U-118-MG был подтвержден результатами измерения способностей клеток формировать колонии, то есть делиться. Результаты анализа выживаемости представлены на Рис. 3.2.3.Б. Из полученных дынных видно, что инкубация клеток глиобластомы с карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч приводила к снижению их выживаемости. Выживаемость клеток U-118-MG, обработанных 100 мМ карнозина, снижалась до 60% по сравнению с контролем (Рис. 3.2.3.Б).

Рисунок 3.2.3. Карнозин дозо-зависимо подавляет пролиферацию клеток глиобластомы. (А) Кривые роста клеток U-118-MG в контроле и при добавлении к среде культивирования 20 - 100 мМ карнозина. Td рассчитывали, как описано на Рис. 3.2.1. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05. (Б) Выживаемость клеток оценивали по способности формировать колонии. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от выживаемости в контроле; n=3, p<0.05.

Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что карнозин оказывает ингибирующее действие на пролиферацию клеток глиобластомы (U-118-MG), карциномы горла и рта (FaDu, Cal27) и молочной железы (MB231). Наиболее выраженный эффект наблюдали в клетках глиобластомы. Избирательность действия карнозина может быть связана с пониженным уровнем экспрессии карнозин-синтетазы и повышенным уровнем экспрессии карнозиназы в клетках глиобластомы по сравнению с клетками карцином.

3.2.2 Карнозин снижает уровень АФК и индуцирует экспрессию MnСОД

АФК принимают активное участие в регуляции клеточной пролиферации. Изменения внутриклеточного уровня АФК часто приводит к нарушениям пролиферативных процессов [24, 25, 67, 174]. Карнозин демонстрирует эффективные антиоксидантные свойства, то есть способен влиять на внутриклеточный уровень АФК [15, 207, 215, 259]. Для того чтобы выяснить, связано ли замедление пролиферации глиобластомы под действием карнозина с изменениями внутриклеточного уровня АФК, клетки обрабатывали карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч и измеряли уровень АФК с помощью проточного цитометра по степени окисления флуоресцентного красителя DCFH₂-DA.

Рисунок 3.2.4. Карнозин снижает уровень АФК в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч. Уровень АФК измеряли, как с описано на Рис. I.2. Результаты представлены в виде среднего значения флуоресценции, рассчитанного относительно контроля. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от уровня АФК в контроле; n=3, p<0.05.

На Рис. 3.2.4. показано влияние карнозина на уровень АФК в клетках U-118-MG. Как следует из Рис. 3.2.4, карнозин приводил к дозо-зависимому понижению уровня АФК в клетках U-118-MG. Клетки, обработанные 50 - 100 мМ карнозина, содержали на 15 - 20% меньше АФК, чем клетки в контроле.

Уровень внутриклеточных АФК контролируется антиоксидантной системой клетки. Снижение уровня АФК возможно как в результате прямого эффекта карнозина, так и при активации антиоксидантных ферментов под действием карнозина. На сегодняшний день прямой антиоксидантный эффект карнозина установлен и хорошо описан в литературе [14, 16, 18, 19]. Для изучения действия карнозина на антиоксидантные ферменты клеток U-118-MG были выбраны два основных антиоксидантных фермента - митохондриальная супероксиддисмутаза (MnСОД) и каталаза. Клетки обрабатывали карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч, затем измеряли активность и экспрессию MnСОД и каталазы.

Рисунок 3.2.5. Карнозин индуцирует экспрессию MnСОД в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали карнозином (25 - 100 мМ) в течение 24 ч. (А) Активность MnСОД, измеренная с помощью метода белкового электрофореза в неденатурирующем геле. (Б, В) Уровень белка MnСОД измеряли методом иммуноблоттинга, актин использовали для нормирования количества белка. (Г) Уровень мРНК MnСОД, измеренный с помощью метода ПЦР в реальном времени. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от уровня мРНК MnСОД в контроле; n=3, p<0.05.

На Рис. 3.2.5.А. представлены результаты измерения активности MnСОД с помощью метода электрофореза в неденатурирующем геле. В данной работе было впервые показано, что инкубация клеток глиобластомы с карнозином усиливает активность MnСОД. Активность MnСОД в клетках обработанных карнозином (50 - 100 мМ) была в 3,3 - 3,6 раз выше, чем в контроле (Рис. 3.2.5.А). Отсутствие изменений в активности цитозольной супероксиддисмутазы (CuZnСОД) (Рис. 3.2.5.А) позволяет предположить, что антипролиферативный эффект карнозина связан со снижением уровня АФК, генерируемых в митохондриях. С помощью метода иммуноблоттинга было выявлено, что повышение активности MnСОД сопровождалось увеличением уровня белка MnСОД. Клетки обработанные карнозином (50 и 100 мМ) содержали в 1,4 - 1,6 раз больше белка MnСОД, чем клетки в контроле (Рис. 3.2.5.Б). Исследование временной зависимости увеличения уровня MnСОД под действием карнозина выявило, что добавление карнозина в концентрации 50 мМ индуцирует увеличение уровня белка MnСОД через 16 ч (Рис. 3.2.5.В). Измерение уровня мРНК MnСОД методом ПЦР в реальном времени показало, что увеличение количества белка MnСОД сопровождалось увеличением мРНК MnСОД. Уровень мРНК MnСОД в клетках обработанных 50 и 100 мМ карнозина был в 1,5 - 2,5 раза выше, чем в контроле (Рис. 3.2.5.Г).

На Рис. 3.2.6. представлены результаты исследования действия карнозина на активность и экспрессию каталазы. Активность каталазы измеряли с помощью биохимического метода на спектрофотометре. Уровень белка определяли с помощью метода иммуноблоттинга. Активность каталазы в контроле составляла 4 мк ед/мг. Клетки обработанные 50 мМ карнозина не демонстрировали каких-либо изменений активности каталазы по сравнению с контролем. В то время как в клетках обработанных 100 мМ карнозина активность каталазы снижалась до 1,5 мк ед/мг (Рис. 3.2.6.А). Снижение активности каталазы сопровождалось соответствующим уменьшением уровня белка. В клетках обработанных 100 мМ карнозина уровень белка каталазы составлял 60% от контрольного уровня (Рис. 3.2.6). Снижение активности каталазы часто приводит к росту прооксидантного уровня, главным образом Н₂О₂. Поскольку роста Н₂О₂ под действием карнозина не происходило, было предположено, что исходное содержание каталазы в клетках U-118-MG настолько мало, что снижение ее активности не оказывает значительного влияния на антиоксидантный эффект карнозина.

Рисунок 3.2.6. Карнозин ингибирует экспрессию каталазы в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч. (А) Активность каталазы измеряли с помощью биохимического метода. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от активности каталазы в контроле; n=3, p<0.05. (Б) Уровень белка каталазы измеряли методом иммуноблоттинга, актин использовали для нормирования количества белка.

Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что карнозин проявляет антиоксидантные свойства в клетках глиобластомы U-118-MG. Карнозин снижал внутриклеточный уровень АФК и усиливал активность и экспрессию антиоксидантного фермента MnСОД.

3.2.3 Карнозин индуцирует G₂ блок и усиливает экспрессию циклина В1

Для того чтобы выяснить, является ли антипролиферативный эффект карнозина результатом изменений в прогрессии клеточного цикла, клетки U-118-MG обрабатывали карнозином (20 - 100 мМ) в течение 24 ч и измеряли количество клеток в G₁, S и G₂ фазах с помощью двухпараметрического анализа.

Рисунок 3.2.7. Карнозин индуцирует G₂ блок в клетках U-118-MG. Клетки инкубировали с карнозином (20 - 100 мМ) в течение 24 ч, метили БДУ и измеряли количество БДУ-положительных (S фаза) и БДУ-отрицательных (G₁ и G₂ фазы) клеток с помощью проточного цитометра. (А) Пример распределения клеток U-118-MG по фазам клеточного цикла. (Б) Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с карнозином. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.

На Рис. 3.2.7.А. представлен типичный пример распределения клеток U-118-MG по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с карнозином. Как видно из Рис. 3.2.7.Б. инкубация с карнозином (20 - 100 мМ) приводила к дозо-зависимому увеличению количества клеток в G₂ фазе и сопровождалась уменьшением числа клеток в S фазе. Распределение в контроле составляло: G₁ - 39%, S - 44% и G₂ - 17% клеток. Карнозин в концентрации от 20 до 50 мМ не приводил к значительным изменениям в распределении клеток. Достоверно отличимый от контроля результат был получен в пробах обработанных карнозином в концентрации 80 - 100 мМ. Количество клеток в G₂ фазе увеличивалось до 39% относительно 17% в контроле, количество клеток в S фазе уменьшалось до 22% относительно 44% в контроле (Рис. 3.2.7.Б). Таким образом, было показано, что инкубация клеток U-118-MG с карнозином приводит к формированию G₂ блока в прогрессии клеточного цикла. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что карнозин ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы за счет модификации прогрессии клеточного цикла через G₂ фазу.