Methylomonas, Methylobacterium organophilum (Anderson, Dawes, 1990; Byron, 1987; 1992; 1994; Dawes, 1990; Braunegg et al., 1998).
Чистый полиоксибутират, однако, хрупок и мало устойчив к растяжению. Недостаточные эластичность и термостабильность ПОБ затрудняют процессы его переработки, что ограничивает возможные области применения. И если бы полиоксибутират был единственным полиоксиалканоатом, он, вероятно, не имел бы больших перспектив. Однако, из активного ила был выделен полимер, свойства которого отличались от ранее изученного полиоксибутирата. Детальный хроматографический анализ показал присутствие в полимере, помимо доминирующей оксимасляной кислоты, оксивалериановой, оксигексановой и, возможно, оксиоктановой кислот в качестве минорных компонентов (Wallen, Rohwedder, 1974). Это был первый обнаруженный гетерополимерный полиоксиалканоат.
Открытие способности микроорганизмов к синтезу гетерополимерных ПОА явилось сильным импульсом для расширения исследований данных биополимеров. Было обнаружено, что присутствие оксивалерата в ПОА существенно влияет на характеристики полимера, снижая температуру плавления и кристалличность материала, делая его по сравнению с полиоксибутиратом более эластичным, упругим и удобным для переработки (Luizier, 1992). Изменение соотношения мономеров в ПОА сопровождается существенными изменениями термомеханических и волоконных свойств материала. После этого поиск микроорганизмов, способных синтезировать гетерополимерные ПОА, был широко развернут во многих странах. Достаточно быстро было установлено, что ряд микроорганизмов в определенных условиях роста, помимо гомогенного полиоксибутирата, способен синтезировать различные полиоксиалканоаты, содержащие в качестве мономерных единиц сополимеры ПОБ и других оксипроизводных углеводородных кислот, – оксивалериановой, оксигексановой и т. д., до мономеров, состоящих из углеродных цепей различной длины, до С12. К настоящему моменту описано свыше 100 различных ПОА (Steinbüchel, Valentin, 1995), однако реально получаемые и исследуемые ПОА – это гомогенный полиоксибутират и сополимеры оксибутирата и оксивалерата (ПОБ-со-ПОВ), а также оксибутирата и оксиоктаноата (ПОБ-со-ПОО). Выявляется, что ПОА различного химического состава обладают различной структурой и базовыми фи- зико-химическими свойствами. Появляются сведения о влиянии параметров режима ферментации, главным образом, источника углеродного питания, на общий выход, состав и отдельные свойства полимеров (молекулярную массу, степень кристалличности, механическую прочность, скорости разрушения в природных и модельных средах) (Spyros et al, 1997; Kim et al., 1998; Pazur et al., 1998; Nagata et al., 1998; Avella et al., 2000a,b). Это открывает перспективы для
40
направленного синтеза биополимеров с заданными свойствами. Однако, эти чрезвычайно важные исследования, начаты сравнительно недавно, а имеющиеся сведения отрывочны и относятся в основном к двум типам ПОА, ПОБ и ПОБ-со-ПОВ, синтезируемым несколькими микробными штаммами.
Вконце 80-х – начале 90-х гг. были развернуты молекулярногенетические исследования биосинтеза ПОА. К настоящему времени изучена и клонирована система синтеза полиоксибутирата из Alcaligenes, Pseudomonas и др. организмов; получены высокопродуктивные рекомбинантные штаммы-продуценты полиоксиалканоатов
(Madison, Huisman, 1999), в т.ч. на основе E.coli, (Lee, Chang, 1994 Lee; 1996; Liu, Steinbüchel, 2000; Wong, Lee, 1998; Klinke et al. , 1999); Pseudomonas putida (Boynton et al., 1999); дрожжей (Leaf et.al., 1996);
атакже трансгенные высшие растения с генами синтеза ПОБ – Arabidopsis thaliana (Poirier et al., 1992; 1995); кукуруза, хлопчатник и др.
(Rinehart et al., 1996).
Внастоящее время многопрофильные исследования полиоксиалканоатов проводятся весьма активно повсеместно. Среди большого количества научных коллективов, плодотворно работающих по проблемам синтеза и изучению свойств данных полимеров, признанными лидерами являются исследователи Института микробиологии, руководимые выдающимся ученым и основателем этих работ профессором Г. Шлегелем (Гетенген, Германия); Институт микробиологии во главе с его директором, профессором А. Стейнбюхелем (Мюнстер, Германия); коллектив профессора Y. Doi Технологического университета (Япония); лаборатория профессора Джендросека (Институт микробиологии Университета Штуггарта, Германия), коллектив, возглавляемый профессором Ли (Химико-биоинженерный центр, Южная Корея); лаборатории профессора Маршальта (Канада), профессора Реах (отделение микробиологии и молекулярной генетики Мичиганского университета, США), профессора Скандола (Отделение химии университета Болоньи, Италия), профессора Сински (Maссачусетский институт технологи (MIT), США), профессора Витольта (Институт биотехнологии, Цюрих, Швейцария). В сфере
коммерциализации ПОА активно работают также многие фирмы и промышленные компания, среди которых – Монсанто К°, Metabolix Inc., Tepha, Proctor & Gambel.
Исследования по микробиологическому синтезу полиоксиалканоатов в России начаты в 70-е годы. Однако публикации 70–80-х годов, главным образом, были связаны с изучением физиологобиохимических особенностей микроорганизмов, принадлежащим к различным таксономическим группам и способных аккумулировать полимер-β-оксимасляной кислоты. Наибольшее количество работ было посвящено изучению физиологии водородокисляющих бакте-
41
рий, а также азотфиксирующих микроорганизмов и роли полиокси– бутирата в процессах клеточного метаболизма и роста (Беляева, 1950; Савельева, Заварзин, Веденина, 1971; Заварзин, 1972; 1977; Романова, 1971; 1975; Романов с соавт., 1974; Романов, 1977; Кондратьева, Гоготов, 1981).
В1977 году был опубликован первый отечественный обзор, подготовленный В. И. Романовым. Автор провел детальный анализ имеющейся литературы по системе биосинтеза, метаболизму поли- β-оксимасляной кислоты у микроорганизмов и ее роли в процессах жизнедеятельности организмов, принадлежащим к различным таксономическим группам.
ВИнституте микробиологии РАН под руководством академика Г. А. Заварзина было выделено, изучено и систематизировано большое количество новых штаммов хемолитотрофных водородокисляющих бактерий, детально исследованы их физиологические особенности, структурно-функциональная организация энергетической и анаболической систем, включая закономерности и стехиометрию синтеза полиоксибутирата (Савельева, Жилина, 1968; Савельева Заварзин, Веденина, 1971; Санжиева, Заварзин, 1971; Заварзин, 1972; 1977; 1982; Ножевникова, Заварзин, 1974; Романова, 1975).
В Московском государственном университете академиком Е. Н. Кондратьевой биохимические аспекты синтеза и внутриклеточной деградации полиоксибутирата как субстрата эндогенного дыхания были рассмотрены в фундаментальном цикле работ, связанном с изучением метаболизма водорода фототрофными, водородными и метилотрофными микроорганизмами (Кондратьева, Гоготов, 1981; Кондратьева, 1983). Впоследствии под руководством Е. Н. Кондратьевой был проведен скрининг коллекции фототрофных бактерий с целью отбора продуцентов полиоксибутирата и выявлена способность отдельных организмов (пурпурных бактерий
Rhodospirillum rubrum и зеленой бактерии Chloreflexus auranticus син-
тезировать до 40 % полимера при определенном соотношении углерода и азота в среде (Кондратьева, Красильникова, 1989).
Значению полиоксибутирата в процессах азотфиксации у свободноживущих и симбиотических диазотрофных микроорганизмов уделено большое внимание в цикле работ сотрудников Института микробиологии РАН и Института биохимии им. А. Н. Баха РАН. Исследована зависимость между внутриклеточным содержанием полиоксибутирата и активностью нитрогеназы и гидрогеназы у ряда штаммов Rhizobium (Бонарцева с соавт., 1988; 1989) и предложены новые флуоресцентные методы тестирования активности клубеньковых бактерий по накоплению полиоксибутирата (Бонарцева, 1985; Бонарцева, Мышкина, 1985).
42
Следует отметить, что вопросам детекции полиоксибутирата в клетках различных микроорганизмов уделено существенное внимание в отечественных исследованиях. Для этого были привлечены и модифицированы биохимический весовой метод (Калачева, Трубачев, 1978), методы ИК-спектроскопии (Анистратова, 1974; Загреба с соавт., 1980; 1982; 1990), оптические методы (Лопатин с соавт., 1996) и методы газожидкостной хроматографии (Волова с соавт., 1992; Короткова с соавт., 1997). С развитием исследований многокомпонентных полиоксиалканоатов для идентификации в составе полимеров микровключений оксикислот с различной длиной углеродной цепи стали использовать методы ЯМР высокого разрешения (Фалалеев с соавт., 1994) и хроматомасс-спектроскопию (Волова с соавт., 1999).
Значимость полиоксибутирата как объекта биотехнологических исследований была обозначена в конце 80-х начале 90-х годов на общесоюзных конференциях, которые были организованы ведущими микробиологическими учреждениями страны («Биосинтез вторичных метаболитов», Пущино–1987; «Лимитирование и ингибирование микроорганизмов», Пущино–1989; «Микробная конверсия», Рига– 1990). К этому периоду сформировались научные коллективы, активно включившиеся в данную тематику. Среди них – Институт микробиологии АН СССР, Институт биохимии им. А.Н.Баха АН СССР, Институт физиологии и биохимии микроорганизмов АН СССР, Институт микробиологии им. А. Кирхенштейна Латв. АН, Институт биофизики СО АН СССР.
Новые обзоры по проблемам биосинтеза полиоксибутирата появились в начале 90-х годов (Волова и Калачева, 1990а; Безбородов, 1991). Своеобразным смотром уровня работ в этом направлении можно считать Российскую конференцию «Биосинтез и деградация микробных полимеров», организованную Институтом физиологии и биохимии микроорганизмов РАН (Пущино, 1996).
В качестве потенциального продуцента полиоксибутирата научными коллективами были избраны микроорганизмы, относящиеся к различным таксономическим группам (Azotobacter, Rhizobium, Methylobacterium, Alcaligenes). По всей вероятности, в выборе объекта исследователи исходили из опыта работы с теми или иными микроорганизмами на базе имеющихся научных заделов.
Так, группой к.б.н. Л. Ф. Савенковой (Институт микробиологии, г. Рига, Латвия) в качестве потенциального продуцента полиоксибутирата были избраны свободноживущие азотфиксирующие бактерии рода Azotobacter. С помощью метода ИК-спектроскопии был проведен скрининг продуцентов полиоксибутирата, имеющихся в коллекции Института микробных штаммов, из которых были отобраны наиболее перспективные. Далее в результате селекции был получен клон (Azotobacter 83), характеризующийся способностью накапливать по-
43
лиоксибутират с высокими выходами (до 80 % и более) и не аккумулирующий полисахариды (Савенкова с соавт., 1987). Последние, как известно, не желательны, так как снижают выход полимера и затрудняют процедуру извлечения полимера из клеточной биомассы. Авторами были изучены закономерности накопления полиоксибутирата бактериями при изменении концентрации и формы азотного питания и напряжения кислорода в среде, и найдены условия, позволяющие получать высокие выходы полимера (Савенкова с соавт., 1990; Загреба с соавт., 1990). Были получены экспериментальные образцы полимера и совместно с Рижским политехническим институтом начаты исследования физико-химических свойств, включая молекулярную массу, температуру плавления и др. (Савенкова с соавт., 1988).
В Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН группа к.б.н. Г. А. Бонарцевой сосредоточила свое внимание на азотфиксирующих клубеньковых бактериях рода Rhizobium. Сотрудниками исследована зависимость внутриклеточного содержания полиоксибутирата в клетках бактерий различных видов клубеньковых бактерий (R. vigna,
R. japonicum, R. phaseoli, R. meliloti ) от активности ключевых фер-
ментов (нитрогеназы и гидрогеназы). При этом выявлена обратная корреляция между активностью нитрогеназы и внутриклеточным содержанием полимера в анаэробных условиях и прямая зависимость между активностью гидрогеназы и внуриклеточным пулом полиоксибутирата (Бонарцева, 1985; Бонарцева с соавт., 1989). Полученные фундаментальные результаты важны для целенаправленного отбора промышленно значимых продуцентов полиоксибутирата. Авторами проанализированы закономерности синтеза полимера у отдельных штаммов и показана возможность стабильного его выхода (Загреба с соавт., 1980). При этом выявлено, что малоактивные штаммы характеризуются большей продукцией полиоксибутирата по сравнению с активными штаммами (Бонарцева с соавт., 1988). Далее были проведены комплексные исследования закономерностей аккумуляции полиоксибутирата различными по активности быстрорастущими штаммами клубеньковых бактерий (Rhizobium phaseoli, R. meliloti, R. trifolii) на разных источниках углерода и азота (Бонарцева с соавт., 1994). Установлена возможность избирательной индукции процесса накопления полимера в клетках бактерий условиями углеродного и азотного питания. На основе полученных результатов среди исследованных штаммов отобран организм, перспективный для массового получения полимера. Установлено, что малоактивный штамм Rhizobium phaseoli 680 на среде с нитратной формой азота и сахарозой способен накапливать до 65 % полиоксибутирата от абсолютно сухого вещества клеток. Синтезируемый полимер характеризуется высокими значениями молекулярного веса, свыше 1 000 000 Da. Совместно с Институтом нефтехимического синтеза РАН и другими органи-
44