зациями научный коллектив получает экспериментальные образцы полиоксибутирата, проводит исследование физико-химических и технологических свойств материала.
В Институте физиологии и биохимии микроорганизмов РАН были развернуты комплексные и систематические исследования метилотрофных микроорганизмов как объекта для биотехнологии полиоксибутирата. Под руководством профессора Ю. А. Троценко проведены обширные исследования способности к синтезу полиоксибутирата у метилотрофных микроорганизмов с различными биохимическими путями усвоения метанола, – в рибулозомонофосфатном цикле (РМФ), сериновом цикле и рибулозобифосфатном цикле (РБФ) (Говорухина, Троценко, 1991). Авторами детально проанализированы 32 штамма и установлено, что наибольшие выходы полимера характерны для факультативных метилотрофов, реализующих сериновый или РБФ-пути усвоения метанола по сравнению с облигатными метилобактериями с РМФ-путем. Максимальное содержание полиоксибутирата (до 80 %) зарегистрировано у пигментированных штаммов с сериновым путем.
Это Pseudomonas rhodos ТК 0010 и Protaminobacter rubber ТК0003.
Далее был выделен и охарактеризован новый факультативный метилотрофный штамм, синтезирующий полиоксибутират, отнесенный к
Methylobacterium extorquens (Доронина с соавт., 1992). Детально изу-
чен внутриклеточный состав липидов, включая состав ЖК, синтезируемых данным организмом. У штамма определены активности ряда ферментов при росте на метаноле и установлено, что в нем реализуется ИЦЛ-вариант серинового пути метаболизма метанола. Были проанализированы метаболические изменения, происходящие при переходе Methylobacterium extorquens от сбалансированного роста на полной питательной среде к режиму накопления полиоксибутирата при исчерпании из среды источника азота (Белова с соавт., 1997). Обнаруженные метаболические перестройки, происходящие в клетках данного продуцента полиоксибутирата, благоприятствующие синтезу полимера, весьма значимы, так как являются научной основой для целенаправленной оптимизации условий выращивания микроорганизма с целью повышения выхода полиоксибутирата. Было установлено, что аккумуляция полимера в клетках M. extorquens стимулируется дефицитом ионов аммония, сульфата, железа и магния в среде (Короткова с соавт., 1995). В результате варьирование условий углеродного питания на примере метилотрофных микроорганизмов с сериновым путем авторам удалось реализовать процесс получения сополимеров оксибутирата с оксивалератом при изменении соотношения мономеров в полимере в достаточно широких пределах. При общих выходах полимера около 50 % получены образцы с включением оксивалерата до 57.4 мол.% (Короткова с соавт., 1997). Изученные и подобранные условия культивирования метилотрофных организмов
45
позволили авторам реализовать лабораторную технологию получения полиоксиалканоатов и приступить к исследованию свойств (Козловский с соавт., 1999).
Большой массив информации о закономерностях синтеза полиоксиалканоатов водородными бактериями и их свойствах получен в Институте биофизики СО РАН, в котором комплексные исследования закономерностей физико-химической регуляции жизнедеятельности хемолитоавтотрофных микроорганизмов с целью разработки управляемых биотехнических систем для получения целевых продуктов и задач экологии проводятся с конца 70-х годов. В работе использованы штаммы, выделенные под руководством академика Г. А. Заварзина сотрудниками отдела литотрофных культур Института микробиологии РАН, и любезно переданные в Красноярск. Серия штаммов, включающая быстрорастущую водородокисляющую бактерию Alcaligenes eutrophus Z1 (Савельева, Жилина, 1968) и три штамма аэробных СО-окисляющих карбоксидобактерий – Seliberia carboxydohydrogena Z1062 (Санжиева, Заварзин, 1971), Pseudomonas gazotropha Z1156 и Comamonas comransoris Z1155 (Ножевнико-
ва, Заварзин, 1974) были введены в массовую культуру и всесторонне изучены в контролируемых условиях при изменении основных физико-химических параметров среды. Результаты исследований кинетики роста, трофики и биотехнологии данных микроорганизмов опубликованы в виде статей в центральных журналах, главным образом, в журнале «Микробиология» и «Прикладная биохимия и микробиология», а также обобщающих изданиях («Непрерывная культура водородных бактерий как средство биосинтеза белка», 1974; «Хемосинтез на водороде», 1978; Производство белка на водороде, 1980; Волова с соавт. Микробиологический синтез на водороде, 1985). Эти результаты дополнили знания о регуляции метаболизма при автотрофии на основе водорода и составили научную основу для практического применения данных микроорганизмов. Культура водородных бактерий Alcaligenes eutrophus была положительно оценена как потенциальное биорегенеративное звено замкнутой экологической системы жизнеобеспечения человека. Установлено, что в сочетании с электролизом воды бактериальное звено с водородными бактериями способно выполнять функции регенератора атмосферы и воды, утилизатора жидких выделений человека и воспроизводителя части рациона человека при существенно большей энергетической эффективности биосинтеза по сравнению с фототрофными организмами.
В Институте биофизики СО РАН разработана технология и создано первое в стране опытное производство белка одноклеточных на основе водорода. Проведенный в производственных условиях комплекс исследований биомассы водородных бактерий показал вы-
46
сокую биологическую ценность нового белкового продукта и эффективность применения в составе комбикормов вместо традиционных белков животного происхождения при выращивании различных с/х животных, птицы, пушных зверей. Всесторонне исследованы штаммы водородных бактерий и карбоксидобактерий, резистентные к окиси углерода. Выявлена специфика бактериальной устойчивости к окиси углерода, заключающаяся в наличии у бактерий СОустойчивых гидрогеназ и способности за счет разветвления дыхательной цепи и усиления мембранного аппарата повышать потребление энергетического субстрата, обеспечивающего клеткам сохранение высокой белоксинтезирующей активности рибосом и скорости размножения в присутствии моноокиси углерода (в концентрации до 10–20 % об.). Этими результатами экспериментально обоснована возможность использования для выращивания бактерий техногенных источников водорода. Исследован химический состав клеток и активность ключевых ферментов автотрофии водорода и окиси углерода во взаимосвязи с условиями культивирования бактерий, на этой основе отработаны режимы суперпродукции, помимо белка, ряда целевых продуктов (гидрогеназ, СО-оксидазы, цитохромов). Показана возможность использования иммобилизированных клеток и НАД-зависимой гидрогеназы бактерий для регенерации НАД, определения Н2, связывания СО из воздуха.
С 1990 года в Институте биофизики СО РАН проводятся комплексные исследования закономерностей микробного синтеза полиоксиалканоатов – термопластичных биоразрушаемых полимеров (ПОА), перспективных для применения в различных сферах. Накопленный опыт работы с данным микробиологическим объектом в течение предыдущих лет и знание характера влияния основных параметров среды на соотношение синтезируемых бактериями азотсодержащих и запасных клеточных макромолекул (углеводной и липидной природы, включая полиоксибутират) позволили за короткий срок оптимизировать условия эффективного синтеза полиоксибутирата водородными бактериями в различных культивационных условиях (Волова с соавт.,1989; 1990 б; 1992а,б). Исследованы закономерности аккумуляции полимера в условиях периодического культивирования бактерий. Выявлена связь между скоростью накопления и внутриклеточным содержанием полимера, физиологической активностью и размерами особей в популяции, находящейся в стадии аккумуляции, а также эндогенной деградации полимера (Волова,1996б). Показана позитивная роль полиоксибутирата для выживания клеток при неоптимальных условиях среды (Волова с соавт., 1996д). Установлена способность к синтезу полиоксибутирата у нового микробного вида – аэробной карбоксидобактерии S. carboxydohydrogena и изучены условия синтеза (Волова с соавт.,1994б). Полу-
47
чено семейство сополимеров оксибутирата с оксивалератом и показана возможность управления соотношением сополимеров условиями углеродного питания (Волова с соавт., 1994а, б; 1996в, е; 1998). В рамках гранта МНФ Сороса исследована возможность аккумуляции бактериями гетерополимерных полиоксиалканоатов. Впервые показана способность природных штаммов водородокисляющих бакте-
рий (A. eutrophus B5786 и S. carboxydohydrogenа Z1062) синтезиро-
вать трехкомпонентные гетерополимерные полиоксиалканоаты, содержащие одновременно коротко- и среднецепочечные мономеры
(Волова с соавт., 1996; 1998).
Разработаны и запатентованы штамм-продуцент и способы получения полиоксибутирата на основе бактерий A. eutrophus, позволяющие с высокими, не менее 70-75%, выходами в отличие от зарубежных решений на не пищевом сырье (смесях водорода и углекислоты или ацетате) получать полимер с молекулярным весом от сотен тысяч до млн. дальтон, а также способ получения сополимеров оксибутирата и оксивалерата с различными соотношениями сополимеров Волова, Калачева, 1996; Волова с соавт., 1996; Стасишина,
Волова, 1996).
Лабораторная технология масштабирована в 30- и 50-литровом аппаратах, в результате определены материальные затраты сырья на синтез полимеров, а также синтезировано семейство полимеров в различных режимах, получены необходимые количества и изучены их свойства. Совместно с ИФ им. Л.В.Киренского СО РАН с использованием ЯМР и ЭПР высокого разрешения исследована молекулярная структура твердого полимера, а также пленок и нитей, полученных на его основе, и растворов полимера в дейтерохлороформе Фалалеев с соавт., 1994; Петраковская с соавт., 1995).
При поддержке Министерства науки и технологий РФ, в рамках проекта Российского фонда технологического развития был разработан Лабораторный технологический регламент получения полиоксибутирата на основе водородного биосинтеза и наработаны первые экспериментальные партии полиоксибутирата. Материал был передан для исследований и технологических испытаний. Совместно с Институтом нефтехимического синтеза РАН, ВНИИволокно, ЦНИИбумаги, ВНИИмедполимер МЗ РФ была показана принципиальная возможность перерабатываемости полиоксибутирата в специальную продукцию (таблетки, нити, гибкие прозрачные пленки) различными методами: поливом из растворов, прессованием при комнатных и высоких температурах, экструзией из расплава. По методу гельтехнологии впервые в России были получены мононити из полиоксибутирата, начато их ориентирование и изучение структуры. Впоследствии из образцов полимеров, синтезированных в ИБФ СО РАН, получены мононити из полиоксибутирата с хард-эластичными свойст-
48
вами, проведено их ориентирование, изучена структура и прочностные свойства (Gordeev, Nekrasov, 1999). В Институте сердечнососудистой хирургии им. Бакулева МЗ РФ были начаты исследования устойчивости и прочностных свойств полимерных пленок при экспозиции их в крови животных. Во ВНИИ бумаги на основе полиоксибутирата и полиэтилена высокого давления удалось получить композиции с различным соотношением компонентов, из которых были отлиты смесовые пленки и показана принципиальная возможность применения композитов для ламинирования бумаги. На кафедре промышленной биотехнологии Московского химико-техноло- гического института им. Д. И. Менделеева проведено исследование влияния полиоксибутирата на типичную микрофлору мясных и молочных продуктов. В ходе трехмесячных экспериментов не было выявлено неблагоприятного воздействия полимерных пленок при их контакте с микроорганизмами на рост и развитие колоний нескольких десятков штаммов.
Впоследние годы усилия коллектива исследователей Института биофизики СО РАН сосредоточены на изучении закономерностей биосинтеза полиоксиалканоатов различного состава с использованием новых источников углеродного питания и изучении структуры, физико-химических, в т.ч. специальных свойств различных образцов. При поддержке Министерства образования Российской Федерации и Американского фонда гражданских исследований и развития для независимых государств бывшего Советского Союза (грант REC-002) по программе «Фундаментальные исследования и высшее образование» реализована концепция экологизации технологий на примере новой химико-биологической технологии получения полиоксиалканоатов, вписывающихся в биосферные циклы. В результате выявленных закономерностей биосинтеза и оптимизированного режима газификации бурых углей научно обоснована, разработана и впервые в биотехнологической практике реализована технология получения ПОА на синтез-газе (Volova et al., 2002; Волова с соавт., 2003; Щипко с соавт., 2003). С конца 90-х годов совместно с Институтом трансплантологии и искусственных органов МЗ России развернуты комплексные медико-биологические исследования полиоксиалканоатов и экспериментальных образцов изделий медицинского назначения из них (Волова с соавт., 2000; Шишацкая с соавт., 2000; 2001а,б; 2002а,б,в,г,д; Шишацкая. 2003; Shishatskaya et al., 2003; Севастьянов
ссоавт., 2001; Sevastianov et al., 2003; Volova et al., 2003).
Внастоящее время в рамках проекта Международного научнотехнического фонда (ISTC) совместно с ООО «Биохиммаш» оптимизируется и масштабируется до уровня Опытного производства лабораторная технология производства полимеров и изделий медицинского назначения из них. Институт биофизики СО РАН по различным
49