Материал: Polioxialkanoaty_POA__biorazrushaemye_polimery_dlya_meditsiny

Анализ литературы показал, что результаты токсикологических исследований полиоксиалканоатов часто были получены на промышленных образцах, а не на материале медицинской степени чистоты (Williams and Martin, 2002). Вместе с тем установлено, что в промышленных образцах полиоксибутирата и сополимеров оксибутирата с оксивалератом, а также других ПОА могут присутствовать обломки микробных клеток, содержащие липополисахаридные и другие комплексы, способные вызывать негативные реакции клеток в системах in vitro и пирогенные реакции in vivo (Rouxhet, 1998; Garrido, 1999). Известно, что эндотоксины ЛПС грамотрицательных микроорганизмов способны вызывать воспалительные и пирогенные реакции

(Ritschel et al., 1988). В работах (Lee et. al., 1999; Williams et al., 1999)

установлено, что количество эндотоксинов в образцах ПОА может составлять до 100–120 U/g. На примере двух продуцентов (природного штамма A. eutrophus и рекомбинантного штамма E. сoli) показано, что в зависимости от способа экстракции полимера из бактериальной биомассы уровень эндотоксинов в полимере можно существенно снизить, до 20 U/g и менее. Это позволяет получать образцы материала, пригодные для медицинских приложений с допустимым уровнем эндотоксинов.

6.1. Исследование биосовместимости полиоксиалканоатов in vitro

Культивируемые in vitro животные клетки являются признанной моделью оценки безопасности новых материалов, лекарственных и косметических средств, пищевых добавок (Фрешни, 1989).

Первый и наиболее изученный из семейства полиоксиалканоатов высококристалличный полимер β-оксимасляной кислоты обладает идеальной бисовместимостью, потому что сам полимер и его дериваты являются естественными продуктам обмена клеток и присутствуют в крови и тканях (Sudesh et al., 200; Martin and Williams, 2002). Однако вследствие хрупкости и невысокой механической прочности полиоксибутират имеет существенные ограничения для применения.

В настоящее время, несмотря на разнообразие, для биомедицинских применений активно исследуется, как было отмечено выше, всего несколько типов ПОА: изомеры и сополимеры оксимасляной кислоты, сополимеры оксиоктаноата и оксигексаноата и сополимеры оксибутирата с оксивалератом. Последние обладают хорошими прочностными свойствами, которые широко варьируют в зависимости от соотношения мономеров, поэтому привлекательны для использования, однако наличие в составе гетерополимерных ПОА, помимо оксимасляной кислоты, других мономеров, в частности, окси-

205

валерата, делает необходимым проверку токсикологических свойств материала в полном объеме.

Имеющиеся результаты токсикологических исследований сопoлимеров оксибутирата и оксивалерата, выполненные в культурах животных клеток in vitro, а также in vivо, свидетельствуют о возможном проявлении воспалительных реакций, интенсивность которых связывают с содержанием оксивалерата в ПОА (Gogolewski et al., 1993; Chaput et al., 1995; Reuch et al., 1999).

Важным моментом в исследовании токсикологических свойств ПОА явилось установление присутствия в промышленных образцах эндотоксинов за счет липополисахаридных комплексов клеточных мембран бактерий – продуцентов полимеров, уровень которых мо-

жет достигать до 100 U (Lee et al., 1999; Williams et al., 1999).

Принципиальная пригодность полимерных пленок из ПОБ для культивирования животных клеток была показана в конце 80-х – на-

чале 90-х гг. (Davies et al., 1989; Engelberg, Kohn, 1991). На примере культуры фибробластов мыши в течение длительного культивирования не обнаружено негативного воздействия ПОБ на рост клеток (Korsatko-Wabnegg et al., 1984). Тестирование гранул ПОБ in vitro с использованием хориоаллантоидных мембран яиц не выявило проявления воспалительных реакций (Saito et al., 1991). Оценка потенциальной токсичности продуктов деградации ПОБ и ПОБ/ПОВ, экстрагируемых буферными растворами при 37°С в сравнение с другими биоразрушаемыми полимерами (полигликолидами и полилактидами) показало предпочтительность ПОА, т.к. продукты их деструкции (3- и 4-оксимасляная кислота и 3-оксивалериановая кислота) обладают в меньшей степени биологической активностью и кислотностью (pKα 4.70 и 4.72 соответственно) в сравнении, например, с гликолевой

(pKα 3.83) и молочной (pKα 3.08) кислотами (Taylor et al., 1994).

Имеющиеся результаты исследования влияния оксивалерата на жизнеспособность животных клеток весьма противоречивы. Опубликованные данные включают как декларирование полной биологической инертности ПОБ-со-ПОВ in vitro, например, в культурах макрофагов и фибробластов (Saad et al., 19977a,b), так и факты цитотоксичности, выраженные, однако, в различной степени в культурах различных клеток. Так, в работах Чапута с соавторами (Чапут с соавт., 1995а, б; Chaput et al.,1995a, b) в ходе исследования роста фибробластов в присутствии экстрактов ПОБ-со-ПОВ с разным включением оксивалерата (7, 14 и 22 мол. %) был обнаружен цитотоксический эффект образцов с наибольшим содержанием оксивалерата. В другой работе в ходе исследования экстрактов из промышленных образцов сополимеров оксибутирата с оксивалератом в культуре фибробластов также отмечено незначительное подавление пролиферативной активности клеток (Dang et al., 1996). При сравне-

206

нии роста фибробластов мыши на пористых пленках из сополимера оксибутирата с оксивалератом (включение оксивалерата 9 мол. %) в сравнение с подложкой из бычьего коллагена установили, что в течение 35 суток рост клеток был сопоставимым, однако продукция белка клетками в 4-х недельных культурах фибробластов была в присутствии ПОБ-со-ПОВ практически в 2 раза выше по сравнению с таковой на коллагеновой подложке (Rivard et al., 1995). Далее пористые объемные подложки из сополимеров ПОБ-со-ПОВ (с включением 9 мол. % оксивалерата) исследованы для целей тканевой инженерии на примере первичных культур овечьих хондроцитов и остеобластов в сравнение в коллагеновыми пластинами (бычий коллаген I-го типа) (Rivard et al., 1996). В течение 35 суток наблюдали рост клеток во всем объеме конструкции, однако прирост клеток на сополимере был существенно (практически на 40 %) ниже в сравнении с контролем (бычий коллаген) в течение всего периода наблюдения.

Последовательные исследования цитотоксичности ПОА и композитов ПОА с различными типами полиуретанов (материал DegraPol/btc®) проводят в Швейцарии под руководством профессора Ульриха Сатера. Показано, что при культивировании макрофагов мыши линии NIH3T3 и фибробластов линии J774 in vitro в среде, содержащей частицы ПОБ, клетки нормально росли, деградируя постепенно ПОБ. Однако при увеличении концентрации полимерных частиц в культуре макрофагов отмечено снижение адгезии и жизнеспособности клеток и повышение продукции NO и TNF (ТНФ-α- фактор). В культуре фибробластов в аналогичных условиях зарегистрировано только снижение фагоцитоза без изменения жизнеспособности клеток и продукции коллагена и фибронектина (Saad et al., 1996; 1997a). Исследование пористых пленок из DegraPol/btc® в культурах макрофагов и фибробластов показало, что адгезия клеток составляла от 65 до 100 % от контроля (полистерина), при этом клетки не изменяли морфологиию и нормально пролиферировали. Макрофаги в аналогичных условиях не изменяли скорости роста и синтеза NO и ТNF (Saad et al., 1997b). Испытания DegraPol/btc® в

первичной культуре тибиальных остеобластов крысы (полимер был внесен в виде мелких кристаллических частиц с флюоресцентными метками (2–20 мкм) показало, что клетки имеют склонность к поглощению полимерных частиц в первые часы культивирования. В ходе 16 суток не отмечено изменения уровня продукции коллагена и остеокальцина, однако уровень щелочной фосфатазы клеток на 4 сутки увеличился до 170 % от контроля. Уровень ЩФ положительно коррелировал с количеством полимерных частиц, поглощенных остеобластами (Saad et al., 1998). Последующее исследование DegraPol/btc® в первичных культурах остеобластов и хондроцитов мыши показало, что на композитах «ПОБ-полиуретаны», содержа-

207

щих дополнительно в качестве смягчающего агента капролактам, клетки хорошо адгезировали, заполняя не только поверхность, но и поры материала (Behrend et al., 1998). При небольших концентрациях DegraPol в среде (2 мг/мл или 40 пг/клетка) клетки сохраняли нормальную морфологию, при этом макрофаги в большей степени по сравнению с остеобластами фагоцитировали частицы ПОБ. Однако при повышении концентрации полимера в среде до 20 мг/мл (400 пг/кл) отмечено снижение жизнеспособности клеток, причем в большей степени у остеобластов, при этом продукция остеокальцина и коллагена типа I не изменялась (Saad et al., 1999). Далее было исследовано влияние витамина D на клетки, пролиферирующие в присутствии ПОА (Saad et al., 2000). Оказалось, что наличие витамина не влияет на продукцию остеокальцина, но тормозит рост клеток и продукцию коллагена. В целом, материал оценен положительно для потенциального применения в будущем в восстановительной хирургии костных тканей.

В связи с противоречивостью данных о биологической инертности полиоксиалканоатов в цикле работ Института биофизики СО РАН и НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ проведено детальное исследование возможного проявления цитотоксичности со стороны ПОА с учетом химического состава полимеров и степени химической чистоты (Шишацкая с соавт., 2000; 2001; Се-

вастьянов с соавт., 2002; Shishatskaya et al., 2003).

Известно, что свойства биоматериалов и степень биосовместимости изделий из них определяются не только структурой и базовыми физико-химическими свойствами исходного материала, но в существенной степени зависят от чистоты образцов и способа получения изделий. Поэтому на первом этапе было проведено исследование сани- тарно-химических свойств водных вытяжек, полученных из пленок и волокон, изготовленных из ПОБ и ПОБ-со-ПОВ (Севастьянов в соавт., 2001), которые являются обязательными при при тестировании новых биоматериалов и предворяют токсикологические испытания (Биосовместимость, 1999).

Экспериментальные образцы полиоксиалканоатов, синтезированных Ralstonia eutropha B 5786, исследованы общепринятыми интегральными методами оценки возможной миграции в модельную среду (дистиллированная вода при различных значениях рН) химических компонентов, входящих в состав полимеров (оксимасляной и оксивалериановой кислот) (Cевастьянов с соавт., 2001; Шишацкая с соавт., 2002). В полученных образцах ПОА не обнаружено примесей белковой и углеводной природы, а также липидов. Содержание отдельных минеральных элементов в образцах cоставляло суммарно менее 0.1 %; среди них идентифицированы: Na (0.036–0.013), Ca

208

(0.005), Mg (0.0013–0.0025), Fe (0.0052–0.009), Cu (0.0046–0.0145), Zn (0.0019–0.0045) в % к абсолютно сухому веществу.

Спектроскопия вытяжек в диапазоне ультрафиолетовых волн, позволяющая определять наличие свободных С=С связей, мигрирующих из изделия в среду, показала, что образцы ПОА, не зависимо от химического состава, отвечают требованиям, предъявляемым к хирургическим материалам. В вытяжках не обнаружено мономеров β-оксикислот (С4 и С5), входящих в состав исследованных полиоксиалканоатов, а также бромирующихся веществ. Показатели окисляемости вытяжек, полученных из полимерных пленок ПОБ и ПОБ-со- ПОВ, так же были значительно ниже уровней, допустимых для материалов медицинского назначения.

Масс-спектральным анализом в вытяжках не обнаружено присутствия мономеров β-оксимасляной и β-оксивалериановой кислот (таблица 6.1).

Для исследования санитарно-химических свойств ПОА-шовных нитей получали водные вытяжки экспонированием образцов в дистиллированной воде в течение 3 сут. при 37°. Изучена также зависимость санитарно-химических показателей водных вытяжек от исходной величины рН воды, использованной в опыте (табл. 6.2).

Таким образом, по изученным показателям принципиальных отличий санитарно-химических свойств у гомогенного полиоксибутирата и сополимерных полиоксиалканоатов не обнаружено. Показано, что все образцы ПОА соответствуют требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям медицинского назначени по данным показателям.

Таблица 6.1 Санитарно-химические показатели водных вытяжек ПОА

(Севастьянов с соавт., 2001)

*Биосовместимость, 1999.

209