Лабораторная работа № 1 Химия белков. Качественные реакции на белки
Белки представляют собой высокомолекулярные полимерные органические соединения, структурными единицами которых
являются аминокислоты. Аминокислоты в молекуле белка |
соединены |
между собой пептидными связями(–СО – NH –), |
образуя |
полипептидные цепи. Пептидная связь возникает между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой, что сопровождается выделением молекулы воды. В белках различают несколько уровней структурной организации. Первичная структура белка определяется числом и последовательностью аминокислотных остатков, соединенных между собой при помощи пептидной связи. Вторичная структура возникает за счет образования водородных связей между группами N – H и О = С
данной полипептидной цепи, что приводит к |
упорядоченному |
расположению гибкой полипептидной цепи в виде |
спиральной или |
складчатой структуры. Третичная структура возникает в результате взаимодействия между боковыми цепями аминокислотных остатков полипептидных цепей. К таким взаимодействиям относятся
водородные, |
дисульфидные и ионные связи, ван-дер-ваальсовы и |
|
гидрофобные |
силы. В |
результате таких взаимодействий |
полипептидная цепь свертывается очень сложным, но вместе с тем определенным образом, приобретая характерную пространственную конфигурацию. Межмолекулярные взаимодействия между отдельными полипептидными цепями, обладающими вторичной и третичной структурой, могут приводить к образованию агрегатов, то есть к возникновению четвертичной структуры белка. Структура белковой молекулы очень лабильна и легко разрушается под влиянием различных физических и химических воздействий, в результате чего изменяются ее биологические и физико-химические свойства.
Присутствие белка в растворах можно обнаружить с помощью цветных реакций, обусловленных наличием в белке аминокислот, их специфических групп и пептидных связей. Существуют универсальные цветные реакции, т. е. на все белки (биуретовая и нингидриновая), и специфические, т. е. на определенные аминокислоты (ксантопротеиновая, Миллона, Фоля и др.).
Биуретовая реакция на пептидную связь (Пиотровского)
Биуретовая реакция обусловлена наличием в белке пептидных связей, которые в щелочной среде образуют с сернокислой медью комплексы фиолетового цвета с красным или синим оттенком.
Группа, образующая пептидную связь, |
в щелочной среде |
|
присутствует в своей таутомерной енольной форме: |
||
О |
Н |
ОН |
ǁǁ |
ǁǁ → |
ǁ |
–С N |
← С N |
|
При избытке щелочи происходит диссоциация ОН-группы, появляется отрицательный заряд, с помощью которого кислород взаимодействует с медью. Возникает солеобразная связь. Кроме того, медь образует дополнительные координационные связи с атомами азота, участвующими в пептидной связи, путем использования их электронных пар. Возникающий таким образом комплекс очень стабилен. Интенсивность окраски комплекса зависит от концентрации белка и количества медной соли в растворе.
Биуретовой реакцией обнаруживаются все без исключения белки, а также продукты их неполного гидролиза – пептоны и полипептиды. Для ди-и трипептидов биуретовая реакция ненадежна. Оттенок зависит от длины полипептидной цепочки. Пептоны при этой реакции дают розовое или красное окрашивание. Биуретовая реакция положительна и с веществами небелкового характера, имеющими в составе не менее двух – CO – NH2-групп, к ним относятся, например, оксамид – NH2 – CO – CO – NH2,
биурет – N2H – CO – NH– CO – NH2.
Исследуемый материал: раствор яичного белка, 1-процентный раствор желатины.
Реактивы: 10-процентный раствор NaOH, 1-процентный раствор
CuSO4.
Оборудование: пробирки, капельницы.
Ход работы. К 5 каплям водного раствора белка добавляют 3 капли 10-процентного раствора NaOH и 1 каплю 1-процентного раствора
CuSO4.
Содержимое перемешивают. Оно приобретает сине-фиолетовый цвет. Нельзя добавлять избыток CuSO4, так как синий осадок маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса.
Нингидриновая реакция на α-аминокислоты
Белки, полипептиды и свободные α- аминокислоты дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином. При нагревании белка
сводным раствором нингидрина аминокислоты окисляются и
распадаются, образуя СО2, NH3 и соответствующий альдегид. Нингидрин, являясь сильным окислителем, вызывает окислительное дезаминирование α-аминокислоты, приводящее к образованию
аммиака, двуокиси углерода, соответствующего альдегида и восстановленной формы нингидрина. Нингидрин восстанавливается и связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака, образуя продукты конденсации, окрашенные в синий, фиолетовый, красный, а в случае пролина – в желтый цвет.
Исследуемый материал: раствор яичного белка, 1-процентный раствор желатины.
Реактивы: нингидрин, 1- процентный водный раствор. Оборудование: пробирки, капельницы.
Ход работы. К 5 каплям раствора белка приливают 5 капель 0,1- процентного водного раствора нингидрина и кипятят 1–2 мин. Появляется розово-фиолетовое окрашивание. С течением времени раствор синеет. Данная реакция не специфична, так как ее дают некоторые амины и амиды кислот.
Ксантопротеиновая реакция на циклические аминокислоты (Мульдера)
Ксантопротеиновая реакция открывает наличие в белках циклических аминокислот – триптофана, фенилаланина, тирозина, – содержащих в своем составе бензольное ядро. Большинство белков при нагревании с концентрированной азотной кислотой дает желтое окрашивание, переходящее в оранжевое при подщелачивании. Реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца этих аминокислот с образованием нитросоединений желтого цвета. При подщелачивании возникает хиноидная структура, окрашенная в оранжевый цвет.
Исследуемый материал: раствор яичного белка, 1-процентный раствор желатины.
Реактивы: концентрированная HNO3, 10-процентный раствор NaOH. Оборудование: пробирки, капельницы.
Ход работы. К 5 каплям раствора белка добавляют 3 капли концентрированной HNO3 и осторожно кипятят. Вначале появляется осадок свернувшегося белка (под влиянием кислоты), который при нагревании окрашивается в желтый цвет. После охлаждения в пробирку наливают по каплям 10-процентный раствор NaOH (до появления оранжевого окрашивания вследствие образования натриевой соли динитротирозина).
Реакция Фоля на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу (цистеин, цистин)
Реакция Фоля указывает на присутствие в белке аминокислот цистина и цистеина, содержащих слабосвязанную серу. В метионине сера имеет прочное соединение, поэтому эту реакцию не дает. Реакция состоит в том, что при кипячении белка со щелочью цистеин или цистин легко отщепляют серу в виде сернистого натрия, который
с плюмбитом дает черный или бурый осадок сернистого свинца. Интенсивность окраски зависит от количества в белке аминокислот
цистина и цистеина и |
от концентрации белка в растворе. Реакция |
|||
протекает по следующим уравнениям: |
|
|||
СН2 – SH |
|
|
CH2OH |
|
| |
+ H2O |
| |
|
|
CHNH2 |
+ 2NaOH |
→ |
CHNH2 + Na2S + 2H2O |
|
| |
← |
| |
|
|
COOH |
|
|
COOH |
|
Цистеин |
|
|
Серин |
|
Na2S + Na2PbO2 + 2H2O |
→ |
PbS + |
4NaOH |
|
←Осадок черного цвета
Исследуемый материал: раствор яичного белка, 1- процентный раствор желатины.
Реактивы: 30процентный раствор NaOH, 5-процентный раствор
(CH3 COO)2 Pb.
Оборудование: пробирки, капельницы.
Ход работы. В одну пробирку наливают раствор яичного белка, в другую – раствор желатины. В каждую пробирку добавляют по 5 капель раствора 30-процентного NaOH и по 1 капле 5-процентного раствора (CH3 COO)2 Pb. При интенсивном кипячении жидкость в пробирке с яичным белком темнеет, образуя черный осадок сернистого свинца. В пробирке с желатиной черного осадка не образуется, так как желатина почти не содержит серосодержащих аминокислот.
Оформление работы. |
Результаты работ оформляют в виде табл. 1. |
|||||
Таблица 1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Названи |
|
Исследуемы |
|
Употребляемы |
Наблюдаема |
Чем |
е |
|
й |
|
е |
я |
обусловлен |
реакции |
|
материал |
|
реактивы |
окраска |
а |
|
|
|
|
|
|
реакция? |
|
|
|
|
|
|
|
Контрольные вопросы
1.Что такое белок?
2.Как связаны между собой аминокислоты в молекуле белка? Напишите трипептид из различных аминокислот. С помощью какой реакции можно их открыть?
3.Напишите аминокислоты, имеющие в своем составе бензольное кольцо. С помощью какой реакции их можно открыть?
4.Напишите аминокислоты, содержащие серу. С помощью какой реакции их можно открыть?
5.Что открывает нингидриновая реакция?
6.Значение цветных реакций на белки.
7.Классификация аминокислот. Строение (формулы) и номенклатура аминокислот.
8.Перечислите структуры белков.
9.Какие существуют дополнительные связи ( помимо основной пептидной), сохраняющие пространственную конфигурацию молекулы белка?