Материал: 03-20-GP-SequencingHumanGenome
Секвенирование ДНК, I поколение
Основные методы секвенирования небольших фрагментов ДНК:
I.Химическая деградация (1976 г метод Максама-Гилберта).
Сейчас применяется для малых фрагментов ДНК 10-100 bp
Этапы:
1) Рестрикция и выделение фрагмента
2) Мечение конца радиакт Р
3) Ограниченное химическое расщепление определенной связи после модификации: в результате весь набор длин фрагментов
Ограничения:
1) Трудоемкость
2) Токсичность реагентов
3) Малый размер фрагментов – до 400 нуклеотидов
Геномика и протеомика
Секвенирование ДНК, I поколение
Основные методы секвенирования небольших фрагментов ДНК:
II. Ферментативный с использованием дидезоксинуклеотидов-терминаторов (метод обрыва цепи или метод Сэнгера, 1975 г.)
Структура терминаторов:
Геномика и протеомика
Секвенирование ДНК по Сэнгеру
ферментативный с использованием дидезоксинуклеотидов
Мечение ДНК для фиксации сиквенса:
1)Праймер – 5’ (радиоакт Р)
2)терминаторы
Фиксация результата:
1) Гель-электрофорез по 4-м дорожкам
Недостатки:
1)Получение
одноцепочечной матрицы (до ПЦР)
2)Трудоемкость чтения результата
3)Размер до ~800 нуклеотидов
Геномика и протеомика
Секвенирование ДНК
Ферментативное секвенирование небольших фрагментов ДНК (сенгеровское): 40 – 1800 bp
Развитие метода секвенирования:
1)введение 4-х флуоресцентных красителя для терминаторов
2)Гель-электрофорез по 1 или 2 дорожкам – чтение до 1800 нукл
3)Капиллярный электрофорез – чтение до 500-1000 нукл
4)Применение односторонней ПЦР
5)Автоматизация всех этапов: нанесения, считывания, анализа
Геномика и протеомика
Стратегия секвенирование геномов de novo
1)Фрагментация ДНК
2)Создание библиотеки генов
3)Анализ больших фрагментов ДНК рестрикционным картированием
4)Прогулки по хромосоме
(направленное секвенирование)
5) Рэндом-секвенирование или шотган-метод (shotgun)
Контиги – набор перекрывающихся коротких фрагментов ДНК (contiguous)
Скаффолд – «ДНК-скелет» из контигов
спромежутками известной длины
Геномика и протеомика