Артефакты. Не следует думать, что для успешного решения задачи разделения достаточно подобрать градиент нетоксического материала. Известны случаи избирательной потери Т-лимфоцитов вследствие контакта с градиентами фиколл — гипак или фиколл — метризоат. У лимфоцитов из крови свиней наблюдали повышение числа розеток, обусловленных наличием Fc-рецепторов к IgG, с 9 до 33% после контакта с 4% фиколлом или 14% декстраном.

Идентификация и подсчет макрофагов и моноцитов

Клетки окрашивают кристаллическим фиолетовым или нейтральным красным, идентифицируют и подсчитывают. В зависимости от густоты суспензии ее разводят в пипетке для лейкоцитов или эритроцитов раствором одного из красителей и переносят в камеру Biirker (смешивают 1 мл раствора кристаллического фиолетового с 10 мл цитрат/NaCl и 90 мл дистиллированной воды или 0,5 мл раствора нейтрального красного с 9 мл раствора Хенкса и 1 мл сыворотки эмбрионов коров, можно лошадиной). При окрашивании кристаллическим фиолетовым клетки подсчитывают через 5 минут после заполнения камеры, при окраске нейтральным красным подсчет ведут через 5— 10 мин после выдерживания камеры на подогретом до 37 °С столике. Кристаллический фиолетовый окрашивает ядра клеток. Это дает возможность отдифференцировать макрофаги и моноциты от лимфоцитов и гранулоцитов. Они выглядят как крупные клетки с круглым или овальным ядром. В их цитоплазме присутствуют светопреломляющие гранулы. Эритроциты при окраске лизируются, поскольку раствор кристаллического фиолетового сильно гипотоничен. Только макрофаги и моноциты прокрашиваются нейтральным красным, в вакуолях которых он откладывается. При подсчете клеток рекомендуется просчитывать 3 группы квадратов камеры Biirker по диагонали из левого верхнего угла в правый нижний. Расчет ведут по следующей формуле:

¹ Фактор разведения — величина, обратная степени разведения

Идентификацию макрофагов и моноцитов в культуре проводят по захвату ими нейтрального красного или коллоидного угля. Для этой цели к культуре клеток добавляют 0,2 мл разведенного нейтрального красного или 0,1 мл разведенной туши. Инкубируют смесь 10 мин при 37 °С и подсчитывают клетки, окрашенные нейтральным красным. Клетки, захватывающие тушь, подсчитывают через 30—60 мин инкубации после отмывания избытка туши. Подсчет клеток ведут под микроскопом, перевернув чашку Петри вверх дном.

Получение культур макрофагов и моноцитов

Готовят среду (Игла-МЕМ или RPMI 1640), добавляя 10 мл сыворотки эмбрионов коров или сыворотки человека группы АВ и 2 мл растворов антибиотиков к 88 мл среды. Сыворотку эмбрионов коров лучше использовать для улучшения культуры мышиных перитонеальных макрофагов, сыворотку АВ — для культивирования моноцитов из крови человека. Количество клеток, которое вносят в культуральную среду, определяется стоящей перед исследователем задачей.

После тщательного перемешивания с культуральной средой суспензию клеток разливают по чашкам Петри (2 мл на чашку), которые затем помещают в эксикатор. Клетки культивируют при 37 °С в водонасыщенной атмосфере, содержащей 7,5% СО₂. После 30—60-минутной инкубации неадгезировавшие клетки удаляют из чашек Петри. Для этого чашки помещают на 5 мин на качалку (60—80 качаний/мин). Надосадочную фракцию отсасывают шприцем, остающийся монослой клеток смывают раствором Хенкса. Для этого в чашки вносят по 2 мл раствора Хенкса и в течение 10 секунд резко качают их в горизонтальном направлении. Раствор Хенкса отсасывают, повторяют процесс отмывки 4 раза, затем инкубируют чашки 24 часа при 37 °С, предварительно добавив 2 мл свежей культуральной среды. В случае работы с перитонеальными клетками получают монослой, состоящий по меньшей мере на 98% из макрофагов. При постоянном культивировании макрофагов или моноцитов каждые 3—4 дня необходимо менять среду. При замене среды монослой клеток несколько раз отмывают раствором Хенкса для удаления погибших макрофагов.

Модификация метода

Если жидкая фаза культуры макрофагов (моноцитов) должна анализироваться при помощи культуры антителообразующих спленоцитов, макрофаги желательно культивировать в той же среде, что и спленоциты (см. раздел "Образование антител культурами клеток"). Иногда возникает необходимость получать большие количества макрофагов, например для изготовления антимакрофагальной сыворотки. В этих случаях суспензию макрофагов (1—2х10⁶ клеток/мл) разливают по 10 мл в чашки Петри диаметром 12 см. В культуральной среде можно при этом заменить добавку 10% сыворотки эмбрионов коров и 20% инактивированной лошадиной сыворотки. Обработку культур проводят как описано выше. Культивирование осуществляют в течение 3—4 дней с ежедневной сменой среды. Образующиеся монослои более чем на 99% состоят из макрофагов. Макрофаги осторожно отделяют от дна чашки стеклянной палочкой, на которую надет кусок мягкого пластикового шланга, выступающий за конец палочки на 10 мм.

Для гистологических или гистохимических исследований рекомендуется культивировать клетки на стеклянных пластинах. Для этой цели одну каплю суспензии клеток наносят на стеклянные пластины, которые инкубируют 1 ч во влажной камере. Неадгезировавшие клетки смывают раствором Хенкса и пластинки помещают в чашки Петри с культуральной средой. Поверхность пластин должна быть покрыта культуральной средой. По окончании культивирования стеклянные пластины отмывают изотоническим буфером, фиксируют клетки любым подходящим способом и окрашивают соответствующим красителем.