Автореферат: Возрастные изменения и половые различия биохимического состава костной ткани человека

Первую фракцию белков костной ткани осаждали при насыщении 25%, раствор выдерживали не менее часа при комнатной температуре, после чего осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин (радиус ротора r=14 см) в течение 30 мин. К полученному надосадочному раствору добавляли раствор сульфата аммония до насыщения 50%. Осадок отделяли в условиях, описанных выше. Точно так же получали фракцию при 75% насыщении. Таким образом, после высаливания получали четыре фракции костных белков: 1 СА, высаливаемая при 25% насыщении сульфатом аммония, 2 СА и 3 СА при 50% и 75% насыщении соответственно, четвертая фракция - супернатант, оставшийся после высаливания и содержащий белки и гликозаминогликаны, не осаждающиеся при 75% насыщении сульфатом аммония.

Все полученные фракции костных белков растворяли в дистиллированной воде, подвергали диализу против воды, а затем лиофильно высушивали. В результате разделения получили шесть фракций компонентов костной ткани. В полученных фракциях определяли количество уроновых кислот, гексозаминов, коллагена по описанным выше методикам и общее количество белка методом Лоури (74), а так же исследовали их ферментативную активность. Для исследования энергетической функции изучали активность лактатдегидрогеназы (К.Ф. 1.1.1.27) Для исследования антиоксидантной защиты костной ткани исследовалась каталазная активность (К.Ф. 1.11.1.6) выделенных фракций по методу P. Hubl. Протеолитическую активность выделенных фракций определяли по количеству выделившихся ароматических аминокислот по Mirski в модификации Jorgensen. Активность щелочной и кислой фосфатаз определяли с помощью наборов «Vital diagnostics SPb» на приборе «Stat Fax-1904 Plus» (США).

Результаты исследований обработаны методом вариационной статистики, применяемым для малых выборок с принятием вероятности (Р), равной 0,05. Нормальность выборок полученных результатов оценивали по критерию Титьена-Мура, которые в дальнейшем обрабатывали методами непараметрической статистики. Для сравнения нескольких возрастных групп использовали критерий Крускала-Уоллиса. В дальнейшем для выявления возрастных различий внутри исследуемой совокупности вычисляли критерий Дана. Достоверность различий между несвязанными выборками определяли W-критерием Вилкоксона для независимых выборок. Результаты исследования представляли медианами, 25 и 75 процентилями. Для исследования корреляционных связей применяли непараметрический критерий Спирмена. При статистической обработке результатов исследования был использован интеграторный модуль Atte Stat 1.0 для программы Microsoft Excel, разработанный в лаборатории информационно-вычислительного центра РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова И.П. Гайдышевым.

Результаты исследования и их обсуждение. Исследование содержания коллагена и нуклеиновых кислот. По полученным нами данным содержание коллагена в компактной костной ткани мужчин уменьшается от 22 до 74 лет, а в дальнейшем возвращается до первоначальных значений и составляет 303 г/100 г сухой обезжиренной ткани (Табл.1.). Кроме этого, нами выявлено, что в возрасте от 22 до 74 лет содержание коллагена в компактной костной ткани достоверно выше, чем в губчатой, как у мужчин, так и у женщин. После 74 лет достоверных отличий не обнаружено. У женщин динамика содержания коллагена несколько отличается от мужчин.

Так у женщин происходит снижение количества коллагена в возрасте 22-55 лет, а затем возрастание до конца исследуемого возрастного периода, от 23,3 до 27,0 г/100 г в компактной и от 19,3 до 22,3 г/100 г в губчатой костной ткани.

Таким образом, содержание коллагена в компактной костной ткани практически здорового человека составляет 25,55,0 г/100 г, в губчатой ткани - 21,23,0 г/100 г сухой обезжиренной ткани.

В отличие от наших данных Л.И. Слуцким и Г.О. Пфафордом показано, что содержание коллагена практически не зависит от возраста, количество этого белка в компактной кости ниже, чем в губчатой, и составляет 15,20,2 и 19,64,6 г/100 г соответственно (Л.И. Слуцкий, Г.О. Пфафорд, 1980).

Для исследования пролиферативной и экспрессивной функций клеток костной ткани определяли количество ДНК и РНК. По полученным данным у мужчин в компактной костной ткани в молодом возрасте количество ДНК достоверно выше, чем в последующие годы, в остальных группах колебания находятся в пределах ошибки (Табл. 2). Такие же изменения количества ДНК происходят и в губчатой кости, однако в последней обнаружено достоверно большее количество ДНК в возрасте 61-74 года по сравнению со вторым зрелым возрастом и старческим. Отмечается, что в спонгиозной кости содержание ДНК достоверно выше в первых трех возрастных группах, однако в возрасте старше 74 лет эти различия сглаживаются.

В компактной костной ткани женщин наблюдается достоверное увеличение содержания ДНК во втором зрелом возрасте практически в 2,5 раза. В отличие от мужчин, в первом зрелом возрасте у женщин не выявлено достоверных отличий содержания ДНК в компактной и губчатой костной ткани. Во втором зрелом, пожилом и старческом возрасте выявлено статистически значимое отличие содержания ДНК. В связи с представленными данными нельзя не отметить тот факт, что количество ДНК имеет широкую вариабельность значений, но не имеет статистически значимых отличий. Скорее всего это связано с невысокой выборкой женской группы, и с тем, что ДНК способна сохраняться в достаточном количестве даже в необменивающейся активно костной ткани.

Результаты исследования РНК свидетельствуют о том, что в губчатой кости мужчин и женщин происходит достоверное снижение ее содержания во втором зрелом возрасте по сравнению с первым зрелым возрастом (Табл.3). В остальных группах достоверных различий нами не выявлено, однако наблюдается тенденция к возрастному снижению содержания РНК у мужчин и увеличению - у женщин. В компактной кости на протяжении всего исследуемого возрастного периода достоверных различий в содержании РНК не выявлено. По полученным нами данным содержание РНК в губчатой кости достоверно выше, чем в компактной кости исследуемых групп мужчин и женщин. В среднем количество РНК в компактной кости составляет 0,028-0,112 г/100 г сухой обезжиренной ткани.

Литературных данных о содержании ДНК и РНК в костной ткани очень немного. Так, Л.И. Слуцкий показывает, что содержание ДНК составляет 0,21 г/100 г, РНК 0,14 г/100 г сухой обезжиренной ткани человека (Л.И. Слуцкий, 1969). Наибольшее количество ДНК и РНК обнаружено нами в губчатой кости, а количество основного белка матрикса коллагена больше в компактной ткани. На наш взгляд, данный факт свидетельствует о том, что активность экспрессивных и биосинтетических процессов в губчатой костной ткани выше, чем в компактной. Коэффициент РНК/ДНК практически во всех группах выше единицы (Рис.2). Наиболее высок этот показатель в губчатой кости и составляет в среднем 2,5, а в компактной - 1,5. Корреляционная зависимость между количеством коллагена и нуклеиновыми кислотами носит обратный характер и составляет r=-0,46 Р=0,0001 с ДНК и r=-0,32 Р=0,0001 с РНК. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что биосинтетическая функция губчатой костной ткани выше, чем компактной.

С возрастом активность обмена компактной и губчатой костной ткани снижается, что приводит к накоплению нерастворимых форм коллагена. Об этом свидетельствует его высокое содержание в возрасте после 74 лет. Нами не выявлено достоверных половых различий в содержании коллагена и нуклеиновых кислот в зрелом возрасте, но после 55 лет у женщин количество последних достоверно выше.

Исследование гликозаминогликанов костной ткани. Для исследования состояния углеводных биополимеров костной ткани нами количественно определялись их мономерные звенья. Исследование показало, что содержание уроновых кислот (УК) в компактной кости мужчин увеличивается с возрастом. Обнаружено, что количество уроновых кислот в компактной кости достоверно ниже, чем в губчатой (Табл.4). Такая закономерность выявлена как у мужчин, так и женщин. Отмечено также, что динамика изменения содержания уроновых кислот в губчатой кости отличается от компактной.