03.00.04 - Биологическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Возрастные изменения и половые различия биохимического состава
костной ткани человека
Накоскин Александр Николаевич
Тюмень - 2004
Работа выполнена в Государственном учреждении науки Российском научном центре «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова
Научные руководители: доктор биологических наук
Светлана Николаевна Лунева
доктор медицинских наук,
Александр Николаевич Дьячков
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Петр Низамиевич Шараев
доктор биологических наук, профессор
Ирина Викторовна Ральченко
Ведущая организация: Челябинская государственная
медицинская академия, г. Челябинск
Защита диссертации состоится « » декабря 2004 года на заседании диссертационного совета ДМ 212.274.07 при Тюменском Государственном Университете (625043, г. Тюмень, ул. Пирогова, 3)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тюменского Государственного Университета (625003, г. Тюмень, ул. Семакова,10)
Автореферат разослан « » 2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук, профессор Е.А. Чирятьев
Общая характеристика работы
В настоящее время в экономически развитых странах Европы и Америки, а в последние годы и России, наблюдается выраженное старение населения А.С. Аврунин, 1999. Эти демографические сдвиги представляют собой социально обусловленный процесс. Старение населения планеты делает актуальными ряд проблем социально-экономического и медико-санитарного характера. Сегодня исследователи уже говорят не о простом увеличении количества лет прожитой жизни человека, а о продлении его творческого долголетия (О. М. Лесняк, 2003).
Старение костной ткани проявляется, прежде всего, интенсификацией и рассогласованием процессов костеобразования и резорбции, в результате чего развивается разрежение костной ткани -- остеопороз (Л.Б. Лазебник, 1999). Сенильный (возрастной) остеопороз определяется у подавляющего большинства людей старше 45--50 лет и является почти универсальным признаком старения организма человека. По данным ВОЗ, остеопоротические изменения выявляются у 15--50 % всего населения России старше 55 лет, при этом у 30% рарефикация кости настолько выражена, что может привести к переломам (Б.Л. Риггз, 2000; Л.Я. Рожинская, 2000; Н.В. Корнилов, 1998).
Несмотря на огромное количество исследований по данной проблеме, невыясненными остаются вопросы об изменениях в химическом составе межклеточного матрикса кости, возникающих с возрастом, и схожести этих изменений с дегенеративными при различной патологии. С каждым годом увеличивается число остеопоротических переломов, лечение их весьма трудоемко и долговременно. Доля переломов у трудоспособного населения также увеличивается (Е.Е. Михайлов, 2003; Л.В. Меньшикова, 2002). Однако недостаточное знание механизмов этого заболевания не позволяет эффективно бороться с ним. Многие исследователи находят в основе патогенеза остеопороза потерю минеральной фазы кости (Л.Я. Рожинская, 1998), некоторые обнаруживают потерю костной ткани в целом (А.А. Свешников 2002; Л.В. Меньшикова и др, 2003), и практически полностью отсутствуют данные о состоянии биополимеров органического матрикса костной ткани.
С развитием техники и урбанизацией населения России и других стран в последние десятилетия участились случаи массовых катастроф, ведущих к появлению неопознаваемых фрагментов тел их жертв. В связи с этим в бюро судебной медицинской экспертизы (СМЭ) все чаще возникает вопрос об определении пола и возраста трупа по его останкам (В. В. Щербаков, 2000). На сегодняшний день нет общепринятой системы оценки возраста человека по остеологическим данным, за исключением методов с применением атомно-абсорбционной спектрометрии, которые недоступны подавляющему большинству бюро СМЭ.
Отсутствие достоверных данных о составе и строении костной ткани людей различного возраста определили направление предпринятых нами исследований. Их необходимость связана также с тем, что остаются неизученными различия в составе костной ткани мужчин и женщин. Кроме того, изучение минерального состава, характеристики состояния биополимеров и ферментных систем костной ткани человека позволят более точно определять возраст индивидуума в судебно-криминалистичеких целях.
Цель исследования. На основе биохимических показателей охарактеризовать возрастные изменения и половые отличия химического состава компактной и губчатой костной ткани человека.
Задачи исследования:
Охарактеризовать возрастные изменения химического состава компактного и губчатого вещества бедренной кости человека.
Изучить возрастное изменение количества минеральных веществ и отношения органической компоненты к неорганической в бедренной кости человека.
Оценить различия в составе компактной и губчатой костной ткани бедренной кости мужчин и женщин в возрастные периоды 21-35, 36-60, 61-74 и более 74 лет. костный ткань бедренный возрастной
Исследовать различие содержания уроновых кислот, сиаловых кислот, гексозаминов, нуклеиновых кислот, коллагена, кальция, фосфатов, магния в компактной костной ткани (КК) бедренной кости и губчатой кости (ГК) головки бедра человека биохимическими методами.
Исследовать ферментативную активность белков, выделенных из компактной костной ткани человека в различные возрастные периоды.
Положения, выносимые на защиту.
1 Биохимический состав и строение костной ткани человека зависят от пола и возраста. С возрастом наиболее изменяются содержание анионов (SO42-, РО43-) минеральной фазы костной ткани. Наибольшие половые различия наблюдаются во втором зрелом возрасте в составе и строении губчатой костной ткани, выражающиеся в достоверном изменении содержания уроновых кислот, увеличении сульфатов и превышающем, более чем в 5 раз содержании ДНК у женщин.
2 Активность биосинтетических процессов, протекающих в губчатой костной ткани человека, выше, чем в компактной кости, что выражается в большем содержании в губчатой кости количества нуклеиновых кислот и невысоком содержании коллагена.
Научная новизна исследования. Впервые комплексно изучены изменения содержания ионов Са2+, РО43-, Мg2+, SO42-, коллагена, нуклеиновых, сиаловых, уроновых кислот, гексозаминов, компактной и губчатой костной ткани человека в возрастном аспекте. Впервые в возрастном аспекте изучены активность щелочной и кислой фосфатаз в нормальной компактной костной ткани человека. Впервые показано различие в биохимических процессах, протекающих в компактной и губчатой ткани человека, отражающееся на биохимическом составе кости. Впервые изучены различия в обменных процессах протекающих в костной ткани у мужчин и женщин в зрелом, пожилом и старческом возрасте.
Практическое значение. В комплексе оценены изменения в химическом составе костной ткани человека в течение жизни, что позволит внести ясность в исследование патогенеза сенильного остеопороза. По результатам работы в лабораторию биохимии Центра внедрены методы исследования, характеризующие состояние биополимеров костной ткани и методы получения биологически активных веществ. Показано, что результаты работы могут быть использованы при определении паспортного возраста в условиях бюро СМЭ.
Внедрение результатов исследования. По теме диссертации оформлено два изобретения: «Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани и косметическое средство по уходу за кожей на основе выделенных гликозаминогликанов» (приоритетная справка на изобретение № 2003131580 033777 от 27.10.2003) и «Способ выделения коллагена из минерализованной соединительной ткани и косметическое средство на его основе» (приоритетная справка на изобретение № 2003134131 036658 от 24.11.2003).
Материалы диссертации включены в планы выполнения курсовых и дипломных работ студентов Курганского государственного университета.
Апробация и публикация работы. Материалы работы доложены на Первом Всероссийском симпозиуме «Возрастные изменения минеральной плотности костей скелета и проблем профилактики переломов», Курган, 2002; работа стала лауреатом республиканской итоговой научно-практической конференции молодых ученых и студентов республики Башкортостан с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины», Уфа, 2004; IX Российском конгрессе «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, Россия. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ в республиканских и областных изданиях.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, представлений о структуре и химическом составе соединительной ткани, материалов и методов исследования, результатов исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 191 работу (из них 113 отечественных, 78 зарубежных); изложена на 111 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 12 таблицами. Диссертационная работа выполнена по плану НИР РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова № 0,34/1-15 (номер гос. регистрации 01. 2. 00 109073).
Содержание работы
Материалы и методы исследования. Исследования были выполнены на 50 трупах людей в возрасте от 17 до 84 лет, умерших от травм, и не имевших костной патологии. Объектом исследования послужили 50 образцов компактной и 50 образцов губчатой костной ткани, выделенных из верхней трети диафиза бедренной кости и головки бедра трупов. Материал для исследования извлекался в соответствии с приказом Минздрава № 694 от 21 июля 1978 г. п. 2.24 «Инструкция о производстве судебно-медицинской экспертизы в СССР». Полученные образцы костной ткани после выделения запаивались в пластиковый контейнер, подвергались заморозке при -700С и хранились не более одной недели до препарирования. Для распределения материала по возрастным группам была использована схема, рекомендованная симпозиумом по возрастной периодизации в институте возрастной физиологии АМН СССР в 1969 году (Л.К. Семенова, 1986). Были исследованы образцы компактной и губчатой костной ткани 35 мужчин и 15 женщин нами были использованы статистические критерии для небольших выборок, таких как критерий Крускала - Уоллиса, Дана.
Препарированную ткань помещали во взвешенные заранее пенициллиновые флаконы, закрывали крышками и взвешивали на электронных весах Balance 6110 (Tecator, UK), После этого навески сырой компактной и губчатой костной ткани замораживали при -700С и высушивали на лиофильной сушке HETO Liolab 3000 (Heto, Германия) в течение суток. Высушенные пробы костной ткани обезжиривали смесью этанол : эфир (1 : 1) в объеме 4 мл смеси на одну пробу. После интенсивного встряхивания жирорастворитель сливали, а костную ткань высушивали в сушильном шкафу в течение суток при температуре 1100С. Полученные таким образом пробы костной ткани хранились в холодильнике в закрытых флаконах на протяжении исследования.
Для определения количества минеральных веществ в костной ткани применяли влажное озоление колбах Кьельдаля, изготовленных из стекла «Pirex», смесью уксусного ангидрида и хлорной кислоты 1:1. Колбу со смесью нагревали на песчаной бане до полного обесцвечивания содержимого. Полученные озоляты нейтрализовали раствором NaOH до рН 6 - 7 по универсальной индикаторной бумаге. Определение ионов Са2+ выполняли на анализаторе «Corning 940» (Corning, UK), используя реактивы той же фирмы. Исследование количества фосфат-ионов проводили фотометрическим методом с молибдатом аммония в присутствии малахитового зеленого (Г.А. Грибанов, Г.А. Базанов, 1976). Сульфатную серу определяли турбидиметрическим методом с хлористым барием в присутствии полиэтиленгликоля со степенью полимеризации n=20000 с использованием спектрофотометра Ultrospec II (США) (К.С. Десятниченко, 1978). Количество ионов Мg2+ в озолятах костной ткани определяли с помощью наборов «Vital diagnostics SPb» на приборе «Stat Fax-1904 Plus» (США). Количество неорганических веществ выражали в граммах, рассчитанных на 100 граммов сухой обезжиренной костной ткани.
С целью исследования органических компонентов костной ткани нам проведено определение низкомолекулярных мономеров гликозаминогликанов и коллагена, а также общего содержания ДНК и РНК (С. Е. Северин, Г.А. Соловьева, 1989). Количество гексоз определяли орциновым методом (C. Holt, 1954). Гексозамины определяли после сухожарового солянокислого гидролиза цельной костной ткани в запаянных ампулах с реактивом Эрлиха. Определение уроновых кислот проводили карбазоловой реакцией (F. Bitter, H.M. Muir, 1962). Сиаловые кислоты определяли тиобарбитуровым методом (Шараев, 1990).Содержание углеводных мономеров выражали в ммоль/100 г сухой обезжиренной костной ткани. Количество коллагена, содержащегося в костной ткани, выявляли по содержанию аминокислоты гидроксипролин, по методу П.Н. Шараева в модификации А.Л. Зайдес. Определение общего содержания ДНК и РНК в костной ткани проводили последовательной экстракцией хлорной кислотой после щелочного гидролиза сухой ткани. Расчет количества нуклеиновых кислот вели по неорганическому фосфату, содержащемуся в них, и выражали в мг/100 г сухой обезжиренной ткани.
Разделение костной ткани проводили по схеме, приведенной на рис.1, предложенной К.С Десятниченко. На первой стадии проводилось измельчение компактного костного вещества на мельнице с ручным приводом до частиц 180-360 мкм. Навеску порошка величиной 2 г помещали в виалу и добавляли 15 мл 0,5 М HCl для деминерализации. Виалу закрывали и помещали на магнитную мешалку в холодильник. Через некоторое время отмечалось повышение рН раствора, и его восстанавливали по универсальной индикаторной бумаге концентрированной соляной кислотой. Деминерализацию костной ткани вели до стабилизации рН, после чего суспензию центрифугировали на центрифуге ЦЛ-1 при 3000 об/мин (радиус ротора r=14 см) в течение 30 мин. Супернатант удаляли декантацией и диализовали против дистиллированной воды, используя диализную пленку фирмы CelluSep, не задерживающую белки весом менее 3500 Да. Содержимое диализного мешка высушивали на лиофильной сушке Heto Liolab 3000 (Heto, Германия). Таким образом, получали 1-ю фракцию. Из деминерализованного костного матрикса (осадка) экстрагировалась вторая фракция, добавлением 3 М хлористого магния. Экстрагирование проводили на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение суток, после чего также центрифугировали 3000 об/мин (радиус ротора r=14 см), диализовали и высушивали надосадочный раствор в условиях, описанных выше. Далее к костному матриксу добавляли 0,1 М соляной кислоты и подвергали пепсиновому протеолизу. К солянокислой суспензии добавляли пепсин (Пищепром, Россия) на кончике скальпеля, виалу закрывали и помещали на магнитную мешалку в термостат при 370С, выдерживали в течение суток. После этого суспензия приобретала коллоидные свойства и практически не содержала нерастворенных частичек матрикса. Нерастворившийся остаток отделяли центрифугированием 1500 об/мин (радиус ротора r=14 см) и отбрасывали. Супернатант в дальнейшем подвергали сульфатов. В губчатой наблюдается схожая тенденция изменения ионов SO42-. У женщин в период до 74 лет количество неорганической серы изменяется мало, однако и в компактной, и в губчатой кости в период после 74 лет выявлено достоверное снижение сульфатов практически втрое. Сравнение содержания сульфатов в костной ткани мужчин и последовательному высаливанию насыщенным раствором сульфата аммония.