На 6-е сутки в контрольной группе флюоресцеиновый тест показал наличие множественных участков окрашивания роговицы менее 3 мм. Показатель флюоресцеинового теста значимо уменьшился только в 3-й группе, где сохранялось лишь точечное окрашивание роговицы флюорисцеином (р=0,04), по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует об эпителизации раневого дефекта роговицы у кроликов.
Суммарная оценка по пяти клиническим признакам, таким как отделяемое в конъюнктивальной полости, степень гиперемии конъюнктивы, отек роговицы, воспалительная инфильтрация, флюоресцеиновый тест, показала, что на 3-й день терапии в 5-й группе животных, получавших аппликации пленок с декаметоксином, отмечена самая высокая суммарная оценка -- 13 баллов по данным клиническим признакам, что свидетельствует о высокой активности воспалительного процесса. Наименьшая оценка -- 9 баллов отмечена в 3-й экспериментальной группе, животные которой получали аппликации пленок с наночастицами серебра-1, наилучший клинический эффект зафиксирован по сравнению с 1 -й контрольной группой, а также 4-й и 5-й экспериментальными группами сравнения (р4-13 5<0,012), что подтверждает наличие противовоспалительной динамики уже на ранних этапах терапии.
На 6-е сутки воздействия в 3-й группе (р4-і,3,5=0,0001) происходит стойкий, статистически значимый регресс по пяти клиническим признакам, а также отмечается стойкая положительная динамика -- 3,2 балла в сравнении с контролем и другими экспериментальными группами, что подтверждает высокий противовоспалительный эффект (рис. 5).
При изучении гистологических препаратов, полученных в ходе эксперимента, были отмечены следующие изменения: в переднем эпителии роговицы в препаратах контрольной группы, а также в гистологических препаратах роговицы кроликов после воздействия пленок с серебром-2 и пленок с декаметоксином на 3-й день эксперимента определялось наличие дефекта с начальной эпителизацией. В препаратах после воздействия пленок с серебром-1 и инстилляций наночастиц серебра на 3-й день воздействия отмечалась неравномерная толщина эпителиального слоя с истончением до 1-2 слоев клеток, такой же эффект присутствовал в препаратах после воздействия декаметоксином на 6-й день эксперимента. Последующее изучение изменений эпителизации на 6-й опытный день показало наличие эпителия нормотипового характера в препаратах после воздействия пленок с наносеребром-1 и наносеребром-2.
При исследовании стромы роговицы в гистологических препаратах контрольной группы животных и группы после воздействия пленок с серебром-2 и пленок, содержащих декаметоксин, на 3-й день эксперимента отмечаются выраженная полиморфноклеточная инфильтрация, обилие нейтрофилов, очаги базофильной дегенерации -- мукоидный отек. Однако в другой серии опыта при наложении пленок с серебром-1, а также в группе кроликов, получавших инстилляции коллоидного раствора наночастиц серебра в конъюнктивальную полость, была определена умеренная инфильтрация с преобладанием лимфоцитов. Очаги базофильной дегенерации -- мукоидный отек, этот же эффект присутствовал в препаратах после наложения пленок с декаметоксином на 6-е сутки воздействия. На 6-й день эксперимента гистологическая картина изменилась, и в препаратах группы после воздействия пленок с наносеребром-1 и наносеребром-2 преобладала слабая инфильтрация, которая местами отсутствовала, отмечалось нарушение стромального рисунка, а именно нерегулярность коллагеновых волокон.
На 3-й день эксперимента, после воздействия пленок с серебром-2 и пленок с декаметоксином, а также инстилляций наночастиц серебра в зоне лимба было отмечено резкое полнокровие сосудов, с умеренной воспалительной инфильтрацией лимфоцитами и наличием отека стромы; такой же эффект отмечался в препаратах после воздействия пленок с декаметоксином на 6-й день эксперимента. В то же время умеренная лимфоцитарная инфильтрация и умеренное полнокровие сосудов преобладали на 3-й экспериментальный день после применения пленок с серебром-1. Уже на 6-е сутки применения пленок с серебром-1 и серебром-2 отмечалось умеренное полнокровие с незначительной лимфоцитарной инфильтрацией или без нее.
Конъюнктива в гистологических препаратах имела резкое полнокровие сосудов с воспалительной инфильтрацией только в препаратах после воздействия пленок с декаметоксином. В остальных препаратах трехдневного эксперимента отмечалось умеренное полнокровие сосудов со слабой воспалительной инфильтрацией в виде лимфоцитов, тогда как при использовании только инстилляций коллоидного раствора наночастиц серебра гистологически отмечалось умеренное полнокровие сосудов без инфильтрации лимфоцитами и только лишь наличие единичных клеток; этот же эффект наблюдался на 6-й день эксперимента после воздействия пленок, содержащих серебро-1 и серебро-2.
Исследование микробной обсемененности конъюнктивальной полости кроликов после моделирования бактериального кератита показало, что до лечебного воздействия в содержимом конъюнктивальной полости был выявлен рост патогенной -- S. aureus (14 глаз); S. haemolyticus (10 глаз) и условно патогенной микрофлоры -- S. epidermidis (4 глаза). У одного кролика (2 глаза) она была смешанной и состояла из сочетания штаммов S. epidermidis и Escherichia coli.
Рис. 5. Суммарная оценка динамики клинических изменений: 1 -- 1-я группа (контрольная); 2 -- 2-я группа; 3 -- 3-я группа; 4 -- 4-я группа; 5 -- 5-я группа; * -- р<0,05
Однако уже после терапии в контрольной и опытных группах на 3-и сутки воздействия выявлен рост патогенной флоры -- S. aureus и S. haemolyticus. S. aureus выявили во всех экспериментальных группах на 14 глазах, кроме животных, на роговицу которых воздействовали пленками с серебром-1. S. haemolyticus также высевался во всех группах на 10 глазах, кроме группы контроля. После 6 дней эксперимента выявлен рост S. aureus в контрольной группе, группе воздействия пленками, содержащими серебро-2 и декаметоксин, всего на 10 глазах. S. haemolyticus был выявлен только в группах животных, получавших коллоидный раствор наночастиц серебра и пленки с декаметоксином, всего на 7 глазах. В опытной группе после 6 дней воздействия пленками с серебром-1 преобладала сапрофитная микрофлора -- S. epidermidis на 6 глазах, а в контроле была отмечена смешанная культура -- S. epidermidis и Escherichia coli на 2 глазах. У экспериментальных животных, получавших пленки с серебром-2, выявлен микст S. aureus и S. epidermidis на 4 глазах.
В результате проведенных исследований мы получили максимальный противовоспалительный эффект, быструю эпителизацию раневого дефекта и санацию конъюнктивальной полости от S. aureus на ранних сроках терапии в группе животных, получавших воздействие пленками, содержащими наночастицы серебра-1, на роговицу глаза, после воспроизведения бактериального кератита средней степени тяжести, по сравнению с другими экспериментальными группами. Данный эффект может обеспечиваться за счет активации систем местного иммунитета, а именно повышения фагоцитарной активности нейтрофилов, что наблюдали мы в ранее проведенной научной работе [7].
Другие авторы также утверждают, что нанодисперсные системы могут на клеточном уровне избирательно влиять на течение воспалительного процесса, при этом основной мишенью регулирующего воздействия наночастиц являются макрофаги [18].
Предыдущими исследованиями показано, что интрадермальное введение наночастиц серебра вызывает изменения функциональной активности фибробластов, митотической активности эпителиоцитов базального слоя эпидермиса, индекса дегрануляции тучных клеток, количества макрофагов в дерме. Причем способность наночастиц повышать функциональную активность фибробластов увеличивается в ряду 207030 нм [19]. Возможно, способность оказывать влияние на течение воспалительного процесса, функциональную активность эпителиальных и соединительнотканных клеток объясняет сокращение сроков эпителизации роговицы при экспериментальном бактериальном кератите. Множество авторов указывают на антибактериальную и антибиопленочную активность наночастиц серебра [2].
Следует отметить, что важна лекарственная форма воздействия, поскольку пленки с наночастицами серебра показали лучший противовоспалительный и антибактериальный эффект, нежели инстилляции. Видимо, это связано с тем, что лекарственное вещество намного дольше удерживается в слезной пленке роговицы в сравнении с минутами их ретенции после традиционных инстилляций [8]. От метода получения наночастиц серебра также зависит положительный клинический эффект терапии бактериального кератита, поскольку лучший результат наблюдался у наночастиц, полученных цитратным методом, в отличие от метода электронно-лучевого испарения и конденсации наноразмерных структур, хотя размер полученных частиц был одинаковым -- 30 нм.
Выводы:
1. Анализ клинического течения и патоморфологических изменений влияния инстилляций наночастиц серебра, наносодержащих пленок и пленок с декаметоксином на течение бактериального кератита средней степени тяжести показал, что наиболее эффективным оказалось применение пленок с наночастицами серебра, полученными цитратным методом. В указаной экспериментальной группе отмечена стойкая положительная динамика течения воспалительного процесса. Применение пленок с декаметоксином и инстилляции физиологического раствора (контрольная группа) не приводило к купированию воспалительного процесса к 6-м суткам. В остальных группах эксперимента к 6-м суткам наблюдения отмечались отдельные признаки воспалительного процесса.
2. На 6-е сутки экспериментальной терапии бактериального кератита средней степени тяжести у кроликов с использованием наночастиц серебра размером 30 нм в форме пленок или капель выявлено санирующее действие на микрофлору конъюнктивальной полости.
3. Эффективность экспериментальной терапии бактериального кератита у кроликов увеличивалась в ряду: пленки с декаметоксином пленки с наночастицами серебра, полученными методом электронно-лучевого испарения, инстилляции коллоидного раствора наночастиц серебра размером 30 нм пленки с наночастицами серебра, полученными цитратным методом.
Литература
1. Деев Л. А., Шаршкова М. А., Козлов Р. С., Дехнич А. В. Факторы риска, структура заболеваемости кератитом: результаты ретроспективного анализа за 2007-2009 гг. в сравнении с 1997-1999 гг. Все новости офтальмологии. Смоленск, 2014.
2. Silver nanoparticles impede the biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus epidermidis / K. Kalishwaralal et al. Tamilnadu, India, 2010.
3. Каспарова Е.А., Собкова О.И., Ян Б. Кросслинкинг роговичного коллагена в лечении инфекционных кератитов и гнойных язв роговицы. Вестник офтальмологии. 2017. № 6. С. 113-119.
4. Каспарова Е.А. Современные методы лечения гнойных язв роговицы. Вестник офтальмологии. 2016. № 5. С. 125-135.
5. New treatments for bacterial keratitis / R. L. Wong et al. J. Ophthalmol. 2012; 2012: 831502.
6. Чекман І.С. Нанонаука: Історичні етапи розвитку. Інтегративна антропологія. 2017. № 1 (29). С. 4-13.
7. Ульянов В.А., Макарова М.Б., Величко Л.Н. Влияние наночастиц серебра на местный иммунитет глаза при моделировании бактериального кератита. Одеський медичний журнал. 2016. № 6 (158). С. 32-38.
8. Preparation, characterization and antimicrobial study of a hydrogel (soft contact lens) material impregnated with silver nanoparticles / B. S. Fazly Bazzaz et al. Cont Lens Anterior Eye. 2014.
9. Аппликация контактных линз с культивированными стромальными клетками костного мозга человека животным с экспериментальной дистрофией роговицы / Ю.А. Демин и др. Проблемы современной медицинской науки и образования. 2008. № 6. С. 18-22.
10. Дрожжина Г.І., Вансович К.В., Гайдамака Т.Б. Спосіб моделювання бактеріального кератиту середнього ступеня тяжкості: пат. 87119 Україна: МПК (2014.01): А61К 35/00 / заявник та патентовласник ДУ «Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова НАМН України». № u201308801; заявл. 15.07.2013; опубл. 27.01.2014, Бюл. № 2.
11. Влияние внешних факторов на стабильность оптических свойств наночастиц серебра / В.А. Смынтына и др. Сенсорна електроніка і мікросистемні технології. 2012. № 3 (9). С. 134-140.
12. Мовчан Б.О., Яковчук К.Ю. Пристрій та спосіб електронно-променевого випаровування й спрямованого осадження парового потоку на підкладку у вакуумі: пат. 98085 Україна: МПК С23С 14/24 (2006.01), С23С 14/28 (2006.01), С23С 14/30 / заявник та патентовласник Міжнародний центр електронно-променевих технологій Інституту електрозварювання ім. Е.О. Патона НАН України. № а201106568; заявл. 25.05.2011; опубл. 10.04.2012, Бюл. № 7.
13. Давтян Л.Л., Тарасенко В.О., Цецура Н.В., Білоклицька Г.Ф. Стоматологічні лікарські плівки для лікування запальних стоматологічних захворювань: пат. на корисну модель 49945 Україна: А 61 К 33/00. № u 2010 02706; заявл. 10.03.2010; опубл. 11.05.2010, Бюл. № 9.
14. Давтян Л.Л., Рева Д.В. Обґрунтування способу введення декаметоксину та лідокаїну гідрохлориду до складу основи лікарських плівок. Фармацевтичний журнал. 2016. № 5. С. 43-49.
15. Douset O., Lanvin M., Thillou C. Reconstituted human corneal epithelium:a new alternative to the Draize eye test for the assessment of the eye irritation potential of chemicals and cosmetic products. Toxicol. Votro. 2006. Vol. 20. P. 499-512.
16. Петруня А.М., Кутайни Мухамед Абдульрахман. Изучение клинических признаков воспалительного процесса в роговой оболочке при одновременном моделировании кератита и конъюнктивита в эксперименте. Офтальмологический журнал. 2013. № 2. С. 83-88.
17. Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів (МВ 9.9.5-143-2007): метод. вказівки. Київ, 2007. 79 с.
18. Нанонаука, нанобіологія, нанофармація / І.С. Чекман та ін. Київ: Поліграф плюс, 2012. 328 с.
19. Сырма Е.И., Скобеева В.М., Ульянов В.А. Размерозависимые морфофункциональные изменения кожи крыс при введении наночастиц серебра. Вісник проблем біології і медицини. 2014. № 3. С. 284-287.