Бактериальные поражения в структуре заболеваний роговицы занимают второе место по распространенности, первое -- по клинической тяжести и скоротечности и могут приводить к слепоте, обусловливая 3,2-5,2 % всей инвалидности по зрению. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), среди причин, приводящих к необратимой утрате зрения, роговичная слепота занимает третье место, составляет от 6,6 до 39,3 % всей слепоты в мире [1].
Анализ характера течения гнойных язвенных поражений роговицы и их исход показывают, что до настоящего времени, несмотря на имеющийся огромный арсенал лекарственных средств, консервативное лечение не всегда является эффективным методом. Использование традиционных медикаментозных средств может способствовать формированию устойчивости микроорганизмов к антибиотикам, что приводит к образованию биопленок и суперштаммов, возникновению дисбактериоза и аллергических реакций [2]. Проблема лечения и реабилитации больных с бактериальными кератитами и гнойными язвами роговицы остается весьма актуальной и далеко не решенной в современной офтальмологии, поэтому на смену прежним методам лечения должны прийти новые, усовершенствованные методы антибактериальной терапии, эффективность которых доказана с математической точностью [3].
Прогрессивный лизис и угроза перфорации роговицы заставляют разрабатывать активные подходы в лечении бактериальных кератитов [4; 5]. Поэтому в современной фармакологии и фармации продолжается разработка новых технологий получения медикаментов. К ним относятся нанонаука, нанотехнологии, наномедицина и нанофармакология [6]. Результаты экспериментальных исследований показали, что частицы металлов с наноразмерами от 0,1 до 100 нм имеют другие физические и физико-химические, биологические, фармакологические свойства, чем металлы макроразмеров. Ученые установили, чем меньше размер наночастицы серебра, тем выше ее бактерицидные свойства. Имеется ряд работ, в которых отмечается, что наночастицы серебра обладают иммуномодулирующим действием [7]. наночастица бактериальный кератит интрадермальный
Очевидно, что использование пленок с наночастицами может быть эффективной альтернативой введению лечебных препаратов в виде глазных капель, поскольку молекулы лекарственного вещества будут намного дольше удерживаться в слезной пленке на роговице в сравнении с 25 мин их ретенции после традиционных инстилляций. Проблема изоляции роговой оболочки от механической травмы, действия окружающей среды, удержание медикаментозных средств на поверхности пораженной роговицы -- весьма значимая в офтальмологии. Для покрытия применяли фибринные пленки, целлулоидные чашечки, мягкие контактные линзы, гидрогелевые и силиконовые линзы. Используемые глазные лекарственные пленки и гидрогелевые контактные линзы, отличающиеся малой толщиной, высоким влагосодержанием и кислородопроницаемостью, имеют определенные преимущества в лечении и в сочетании с медикаментозной терапией позволяют дозировать препарат и обеспечивать пролонгированное действие. Однако не все больные хорошо их переносят, да и выбор глазных лекарственных пленок и специализированных гидрогелевых линз весьма невелик [8].
Цель работы -- оценить динамику клинических, патоморфологических и микробиологических изменений в эксперименте на кроликах при терапии бактериального кератита с использованием наночастиц серебра размером 30 нм в форме пленок и инстилляций.
Экспериментальные исследования проведены в соответствии с изложенным в Хельсинской декларации и Законе Украины «О защите животных от жестокого отношения» (№ 1759-6 от 15.12.2009 г.), с учетом рекомендаций относительно проведения научных морфологических исследований [9].
Для проведения эксперимента использовали 15 кроликов (30 глаз) массой 2,2-2,7 кг породы Шиншилла. Всем животным моделировали бактериальный кератит средней степени тяжести. Моделирование выполняли под внутривенным тиопенталовым наркозом (в разведении с 10 мл физраствора из расчета 1 мл/кг массы тела животного) и местной анестезией (инстилляции в конъюнктивальную полость 0,5 % Sol. Alcaini) путем выполнения послойной трепанации роговицы в оптической зоне до 2/3 толщины стромы, с дальнейшей стромэктомией и инстилляцией культуры Staphylococcus aureus, выделенного от пациента, в большой концентрации (109 клеток/мл) в конъюнктивальную полость с последующим введением субконъюнктивально дипроспана (0,2 мл), а также ежедневными трехразовыми инстилляциями 0,1 % раствора дексаметазона в течение 5 дней [10]. После получения модели кератита средней степени тяжести все экспериментальные животные были разделены на 5 групп:
1- я группа -- контрольная, кролики получали инстилляции физиологического раствора в конъюнктивальную полость;
2- я группа -- кролики получали инстилляции в конъюнктивальную полость коллоидного раствора наночастиц серебра размером 30 нм;
3- я группа -- кроликам накладывали на роговицу пленки с наночастицами серебра-1 (наночастицы получены цитратным методом, размер 30 нм);
4- я группа -- кроликам накладывали на роговицу пленки с наночастицами серебра-2 (наночастицы получены методом электронно-лучевого испарения, размер 30 нм);
5- я группа (сравнения) -- кроликам накладывали на роговицу пленки с декаметоксином.
Во всех группах после воздействия проводили блефарорафию, зашивая веки кроликов в центре п-образным швом.
Наночастицы серебра-1, включенные в пленку, и наночастицы, использованные в виде инстилляций, получали цитратным методом [11].
Наночастицы серебра-2 были получены методом электронно-лучевого испарения и конденсации наноразмерных структур [12].
Пленки получали методом полива на полированную поверхность, используя в качестве основы полимеры полиакриламид, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и натрий-карбоксиметилцеллюлозу [13]. Концентрация наночастиц серебра-1 и серебра-2 в пленке составляла 10 мг/г, а декаметоксина -- 12,5 мг/г [14].
Клинические наблюдения проводили ежедневно. Фоторегистрацию объективного осмотра выполняли с помощью цифровой камеры Canon. Размеры изъязвления определяли при помощи флюоресцеинового теста. Клинические признаки воспалительного процесса оценивались модифицированным тестом Draise [15; 16] на 3-и и 6-е сутки эксперимента. Бальная оценка выраженности степени воспаления строилась на основании таких признаков: отделяемое конъюнктивальной полости, степень гиперемии конъюнктивы, степень отека роговицы, степень воспалительной инфильтрации роговицы, площадь окрашивания поверхности роговицы флюоресцеином. Признаки оценивались в баллах по следующей условной шкале:
Отделяемое конъюнктивальной полости:
0 -- отсутствует;
1 -- слизистое скудное;
2 -- слизистое обильное;
3 -- слизистое гнойное.
Степень гиперемии конъюнктивы:
0 -- бледно-розовая, соответствующая физиологической норме;
1 -- слабая гиперемия конъюнктивы глазного яблока;
2 -- умеренно выраженная гиперемия конъюнктивы глазного яблока;
3 -- выраженная гиперемия конъюнктивы глазного яблока.
Отек роговицы:
0 -- отек роговицы отсутствует, роговица прозрачная на всем протяжении;
1 -- локальный отек эпителия роговицы в зоне воспаления;
2 -- локальный отек эпителия с переходом на поверхностные слои стромы;
3 -- локальный отек в поверхностных и средних слоях стромы.
Воспалительная инфильтрация:
0 -- инфильтрация отсутствует;
1 -- точечные единичные (не более трех) субэпителиальные инфильтраты;
2 -- точечные множественные (более трех) субэпителиальные инфильтраты;
3 -- множественные субэпителиальные инфильтраты размером более 1 мм;
4 -- локальная инфильтрация в поверхностных и средних слоях стромы.
Флюоресцеиновый тест:
0 -- отсутствует;
1 -- точечное окрашивание роговицы;
2 -- площадь окрашивания менее 3 мм2;
3 -- площадь окрашивания более 3 мм2.
Статистическая оценка проводилась дисперсионным анализом для повторных измерений ANOVA с последующим использованием LSDтеста. Полученные результаты также были проверены непараметрически Kraskal-Wallis ANOVA c помощью программы “Statistica 9.0”.
Гистоморфологическое исследование проведено на базе лаборатории патоморфологических и электронно-микроскопических исследований ГУ «Институт глазных болезней и тканевой терапии им. В. П. Филатова НАМН Украины» (заведующий лабораторией проф. В. В. Вит).
Морфологическое исследование выполнено по общепринятой методике после выведения кроликов из эксперимента методом воздушной эмболии под тиопенталовым наркозом. Энуклеированные глаза животных фиксировались в 10 % нейтральном формалине и заключались после общепринятой проводки в «Гистомикс» (Biovitrum). Из блоков готовились гистологические срезы толщиной 10 мкм, которые окрашивались гематоксилин-эозином и заключались в канадский бальзам. Срезы были исследованы под микроскопом Jenamed 2. Фотографировали на этом же микроскопе с использованием цифровой камеры “Canon DS 6031” при увеличении 400x200x. Фото обрабатывались с помощью программы “Microsoft Office Picture Manager”. При исследовании учитывались особенности строения глаза кролика.
Оценивали гистологические изменения эпителия и стромы роговицы, а также лимба и конъюнктивы.
Микробную обсемененность конъюнктивальной полости у кроликов определяли путем забора материала, после получения модели кератита средней тяжести на 3-и, 6-е сутки терапии с соблюдением правил асептики и высевали на 1 % сахарный бульон, а также на чашки Петри с 5 % кровяным агаром, культивировали при температуре 37 °С. Через сутки посевы просматривались, отмечался характер роста на бульоне. На чашках Петри с кровяным агаром определяли степень обсемененности и наличие гемолиза. Культуру после предварительного микроскопирования пересевали с кровяного агара на мясопептонный и сывороточный агар. Затем проводили идентификацию выделенных культур микроорганизмов. Для установления родовой и видовой принадлежности выделенных штаммов были исследованы их морфологические, культуральные и биохимические свойства [17].
При моделировании бактериального кератита средней степени тяжести уже через 24 ч после повреждения и инфицирования роговицы развивается бактериальный кератит с вовлечением в воспалительный процесс конъюнктивы, а также эпителия и стромы роговицы. У всех экспериментальных животных клинические признаки на 1-е сутки наблюдения были одинаковы. Наблюдались незначительная гиперемия и отек век, обильное гнойное отделяемое, выраженная смешанная инъекция конъюнктивы, хемоз конъюнктивы, отек роговицы, более выраженный вокруг воспалительного очага. В оптической зоне определялся инфильтрированный очаг, покрытый детритом (рис. 1).
Оценка полученных результатов на 3-й день воздействия показала, что такие клинические признаки, как отделяемое из конъюнктивальной полости, степень гиперемии конъюнктивы и показатели флюоресцеинового теста, статистически значимо не изменялись у животных 2-й группы, получавшей инстилляции коллоидного раствора наночастиц серебра, и 3-й группы, лечение которым проводили пленками с наночастицами серебра-1, по сравнению с контрольной группой, получавшей инстилляции физиологического раствора. Отек роговицы нарастал в 5-й экспериментальной группе животных (р=0,031), получавших воздействие декаметоксинсодержащими пленками на роговицу, по сравнению с контрольной группой и имел вид преимущественно локального отека эпителия с переходом на поверхностные слои стромы (рис. 2). В 5-й группе наблюдалось значимое увеличение воспалительной инфильтрации (р=0,05) уже на 3-й день терапии в сравнении с контролем. Уменьшение воспалительной инфильтрации произошло в 4-й экспериментальной группе животных, которые получали аппликации пленок, содержащих наночастицы серебра-2 (р=0,05), по сравнению с контрольной группой на 3-й день исследования.
На 6-е сутки лечебного воздействия в контрольной группе животных сохранялось обильное отделяемое из конъюнктивальной полости преимущественно гнойного характера. Во 2-й группе животных, получавших инстилляции коллоидного раствора наночастиц серебра (р=0,006), отделяемое было обильное и имело преимущественно слизистый характер. В 4-й группе животных, получавших аппликации пленок с наночастицами серебра-2 (р=0,002), отделяемое было обильное и имело слизистый характер по сравнению с контролем (рис. 3). В 4-й группе, животным которой накладывались пленки с наночастицами серебра-1, отделяемое было слизистое скудное (р=0,0001) по сравнению с контролем.
Рис. 1. Глаз кролика после моделирования бактериального кератита. Язва роговицы, инфильтрат, слизисто-гнойное отделяемое конъюнктивы
Статистически значимое уменьшение степени гиперемии конъюнктивы на 6-е сутки произошло во 2-й группе животных, получавших инстилляции коллоидного раствора наночастиц серебра. У данных кроликов наблюдалась слабая гиперемия конъюнктивы (р=0,03) по сравнению с контрольной группой животных, у которых присутствовала умеренно выраженная гиперемия конъюнктивы глаза. В 5-й группе была отмечена выраженная гиперемии конъюнктивы у экспериментальных животных, которым проводили аппликацию пленок с декаметоксином (р=0,0001), по сравнению с группой контроля.
Рис. 2. Глаз кролика после моделирования бактериального кератита при воздействии декаметоксинсодержащими пленками, 3-и сутки эксперимента. Гиперемия конъюнктивы, слизистое отделяемое, диффузный отек роговицы, ограниченный неинтенсивный инфильтрат
Рис. 3. Глаз кролика после моделирования бактериального кератита на 6-е сутки после воздействия пленками с наночастицами серебра-2. Ограниченный отек роговицы, инфильтрат в центре
Такой показатель, как отек роговицы, снижался и имел вид локального отека эпителия роговицы в зоне воспаления на 6-й день эксперимента во 2-й группе животных, уровень значимости составил р=0,01 по сравнению с контролем; в 3-й группе (рис. 4) также произошло значимое уменьшение данного показателя (р=0,0001) по сравнению с контрольной группой, в которой сохранялся локальный отек в поверхностных и средних слоях стромы.
Отмечен регресс воспалительной инфильтрации в виде точечных единичных субэпителиальных инфильтратов на 6-е сутки терапии в 3-й группе (р=0,05) по сравнению с контрольной, где были отмечены множественные субэпителиальные инфильтраты размером более 1 мм.
Рис. 4. Глаз кролика после моделирования бактериального кератита на 6-е сутки после воздействия пленками с наночастицами серебра-1. Локальный отек, инфильтрации нет