Статья: Влияние дефолиации березы повислой (Betula pendula R.) непарным шелкопрядом (Lymantria dispar L.) на состав и содержание химических соединений в листьях

Ботанический сад Уральского отделения РАН

Влияние дефолиации березы повислой (Betula pendula R.) непарным шелкопрядом (Lymantria dispar L.) на состав и содержание химических соединений в листьях

Е.В. Колтунов

Аннотация

Вспышки массового размножения растительноядных лесных вредителей оказывают значительное негативное эко лого-экономическое воздействие на общее состояние лесов, поэтому изучение биохимических механизмов энтоморезистентности древостоев (индуцированной и конститутивной) остается весьма актуальным. Целью исследования было изучение биохимической специфичности вышеуказанных типов энтоморезистентности методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Проведенный нами хроматографический анализ общего количества химических соединений показал, что содержание 59.02% фракций в листьях дефолиированных древостоев увеличивалось, в то время как у 36.06% фракций оно снижалось, а у 4.92% не изменялось. Всего нами было идентифицировано 20 химических соединений. Содержание 55% соединений возрастало под влиянием дефолиации, у 40% соединений оно снижалось, а у 5% не изменялось. Первая группа соединений включает фенолгликозиды (арбутин, салицин), флавоноиды (изокверцитрин, лютеолин, кверцетин, апигенин, мирицетин, кемпферол), гидроксикарбоновые (галловая кислота) и гидроксикоричные кислоты (кафтаровая кислота), витамины (аскорбиновая кислота). Ранее нами был определен состав фенольных соединений, детерминирующих конститутивную энтоморезистентность у березы повислой. Сравнительный анализ их состава и выявленных нами соединений индуцированной энтоморезистентности показал очень близкое сходство. Следовательно, можно предположить, что параметры индуцированной и конститутивной энтоморезистент- ности у березы повислой детерминируют идентичные фенольные соединения.

Ключевые слова: непарный шелкопряд, береза повислая, листья, дефолиация, высокоэффективная жидкостная хроматография, химические соединения

The Effect of Defoliation of Silver Birch (Betula pendula R.) by Gypsy Moth (Lymantria dispar L.) on the Composition and Content of Chemical Compounds in Its Leaves under Anthropogenic Influence

Abstract

Periodic outbreaks of insects cause significant ecological and economic damage to forests. For this reason, it is especially important to study the biochemical mechanisms underlying entomoresistance, either induced or constitutive, in forest stands.

The purpose of the study is to investigate the biochemical specificity of these types of entomoresistance using the method of high-performance liquid chromatography (HPLC). It has been shown for the leaves of the defoliated stands that 59% of fractions increased in content, while the content of 36% of fractions decreased and 4.9% of fractions exhibited no changes in their concentration. A total of 20 compounds have been identified. It has been observed that the content of the identified compounds under the effect of defoliation increased (55%), decreased (40%), or did not change (5%). The first group of compounds includes phenol glycosides (arbutin, salicin), flavonoids (isoquercitrin, luteolin, quercetin, apigenin, myricetin, kaempferol), hydroxycarboxylic acids (gallic acid), hydroxycinnamic acids (caftaric acids), and vitamins (ascorbic acid). Previously, we revealed the composition of phenolic compounds determining constitutive entomoresistance. The comparative analysis of their composition and the identified compounds of induced entomoresistance has shown a very close similarity. Therefore, it can be suggested that the parameters of induced and constitutive entomoresistance in silver birch are determined by the same phenolic compounds.

Keywords: gypsy moth, silver birch, leaves, defoliation, high-performance liquid chromatography, chemical compounds

Введение

Периодические крупномасштабные вспышки массового размножения лесных насекомых-филлофагов с высоким биотическим потенциалом наносят заметный эко лого-экономический ущерб лесам и нередко служат фактором значительного снижения резистентности древостоев даже при отсутствии массового усыхания [1, 2]. Это сопровождается также снижением устойчивости лесов к воздействию других негативных биотических и абиотических факторов [3, 4]. В результате временно ослабленные леса нередко поражаются инфекционными болезнями и насекомыми-ксилофагами [1, 5, 6]. При этом последовательность поражений древостоев различными болезнями, вызванными дефолиацией, и ксилофагами может быть совершенно различна [6]. Ранее нами показано, что сильная дефолиация крон березы непарным шелкопрядом (ЬутапМа dispar Ь.) в сочетании с интенсивной засухой вызывает заметное временное снижение устойчивости березняков в условиях антропогенной трансформации, что становится причиной массовой пораженности березы бактериальной водянкой и последующего усыхания [1]. В итоге суммарный эко лого-экономический ущерб от комплекса последующих факторов может значительно превышать таковой от воздействия только одного фактора дефолиации.

Исходя из всего вышесказанного становится очевидно, что исследование биохимических механизмов энтоморезистентности у древесных растений - одно из перспективных направлений изучения взаимоотношений в системе «дерево - насекомые». Эта область развивается особенно интенсивно. Однако однозначной картины относительно функционирования механизмов энтоморезистентности (как конститутивной, так и индуцированной) пока нет [7-17].

Многими авторами было показано, что возрастание уровня энтоморезистентности в хвое и листьях древостоев детерминируется фенольными соединениями, алкалоидами и терпеноидами [7, 11-17]. Известно, что у лиственных древостоев доминирующее значение в энтоморезистентности имеют именно фенольные соединения и, в первую очередь, флавоноиды [11]. Причем фенольные соединения контролируют как конститутивную, так и индуцированную резистентность лиственных древесных растений [8]. Тем не менее некоторые алкалоиды также имели высокую антифидантную активность для непарного шелкопряда [18].

В результате многочисленных исследований было обнаружено, что количество фенольных соединений в листьях кормовых растений после дефолиации насекомыми-фитофагами, возрастает [7, 11, 13, 15, 16]. Особенно значительное изменение их содержания наблюдается на следующий год после дефолиации [19]. Это обусловлено высокой антифидантной и детеррентной активностью, в первую очередь, флавоноидов [20, 21]. Кроме того, фенольные соединения также связаны с механизмами резистентности древесных и травянистых растений к патогенным грибам [22].

Древесные растения достаточно активно реагируют и на воздействие различных других негативных экзогенных факторов среды. Так, антропогенное воздействие, уменьшение светового потока, воздействие фактора абиотического стресса (засухи) снижают общее содержание флавоноидов в листьях [23]. Одним из важных механизмов индуцированной энтоморезистентности фенольных соединений служит их функционирование в тесном взаимодействии с полифе- нолоксидазами. Последние взаимодействуют с фенольными соединениями при повреждении клеток растений, образуя высокореакционноспособные хиноны, обладающие значительной токсичностью [24]. Можно предположить, что это не единственный механизм антифидантного воздействия на насекомых- филлофагов. В частности, результаты исследований с добавлением фенольных соединений в искусственную питательную среду (ИПС) убедительно продемонстрировали, что они заметно подавляли рост и выживаемость гусениц на ИПС [25]. В условиях эксперимента было выявлено также явное предпочтение непарным шелкопрядом листьев с низким содержанием фенольных соединений [26]. Это подтверждает наличие детеррентных свойств у фенольных соединений.

Основной целью проведенного исследования было изучение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) воздействия фактора дефолиации на состав и содержание фенольных соединений в листьях березы повислой в лесостепи Зауралья в условиях антропогенного воздействия в год дефолиации, то есть «быстрой» индуцированной энтоморезистентности, а также сравнительный анализ биохимического сходства и различий в составе фенольных соединений, детерминирующих параметры индуцированной и конститутивной энтоморезистентности у березы повислой. Состав фенольных соединений, детерминирующих параметры конститутивной энтоморезистентности у березы повислой после дефолиации непарным шелкопрядом, был идентифицирован нами ранее [8, 9].

Материалы и методы

Район очагов массового размножения непарного шелкопряда находился в березовых лесах Каменск-Уральского р-на Свердловской обл. Всего нами было заложено 10 пробных площадей размерами 50*50 м каждая, по 5 на очаги и за их границами. Пробные площади располагались в березняках вблизи пос. Покровское (56°28'43.7" с.ш., 61°36'06.9" в.д.; 56°28'42.0" с.ш., 61°35'42.8" в.д.)), контрольные - вблизи пос. Храмцовское ((56°33'08,3" с.ш., 61°26'53.3" в.д.; 26°32'53.6" с.ш., 61°26'48.3" в.д.), где фактор дефолиации полностью отсутствовал. Уровень антропогенной трансформации фитоценозов в очагах был значителен (4-я стадия по классификации [27]). Сбор листьев березы повислой для хроматографического анализа из очагов массового размножения непарного шелкопряда проводился в 2012-2017 гг. на пробных площадях с 70%-ной дефолиацией крон и за границей очагов, где отсутствовала дефолиация в сходных лесорастительных усл о- виях. Сразу после отбора проб листья березы высушивали при комнатной температуре, затем размалывали. Навеску размолотых листьев (2 г) помещали в емкость с 50 мл этанола. Экстракцию фенольных соединений из листьев березы проводили в водяной бане с обратным холодильником 96%-ным этиловым спиртом в течение 30 мин при кипении раствора. Затем супернатант центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин и пропускали через шприцевой фильтр (0.45 мкм). Хроматографический анализ проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-20 со спектрофотометрическим УФ-детектором (фирма Shimadzu). Для этого использовалась хроматографическая колонка PerfectSil Target ODS -3 5 мкм с обращенной фазой, размерами 250 * 4.6 мм (фирма Shimadzu). Объем пробы - 20 мкл. Детектирование элюента осуществляли одновременно на двух полосах поглощения: (, 360 нм А, 254 нм) и вычислялось спектральное отношение параметров абсорбции. Нами использовалась хроматография в диапазоне 10-50% со скоростью 1 мл в мин - при температуре 40 °С. Элюент А - ацетонитрил -

0. 05 М фосфатный буферный раствор (рН 3.0) в 10%-ном растворе ацетонитрила; элюент В - ацетонитрил - вода (9: 1). Элюирование проводилось с возрастанием доли элюента В от 10% до 50%. Продолжительность хроматографического анализа - 45 мин. Из них от 0 до 30 мин проводилось градиентное элюирование в диапазоне 10-50%, затем в течение 15 мин - при концентрации 50%.

Для идентификации соединений использовали собственную базу данных 20 ве- ществ-свидетелей фирм: Fluka, Sigma, Aldrich. Для идентификации хроматографических фракций использовался общепринятый метод на основе идентификации соединений по t_R (время удерживания) и спектральное отношение (X 360 нм/ X 254 нм). Общее количество образцов для хроматографии - 40. Хроматографический анализ каждой пробы проводили в трех повторностях. Затем рассчитывали среднее значение. Статистическую достоверность полученных результатов определяли с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Градиентный хроматографический анализ химических соединений из листьев березы как в дефолиированных насаждениях, так и в интактных выявил от 61 до 74 фракций (рис. 1). Сравнительный тотальный анализ идентичных соединений в обоих вариантах показал, что в группе дефолиированных древостоев из исследованных очагов у 59.02% фракций их содержание увеличивалось по сравнению с контролем, у 36.06% снижалось и у 4.92% не изменялось. Таким образом, доминирующей реакцией химических соединений в листьях березы повислой на дефолиацию было заметное возрастание их количественного содержания.

Рис. 1. ВЭЖХ химических соединений из листьев березы повислой в очагах массового размножения непарного шелкопряда и за их границами: 1 - аскорбиновая кислота; 2 - арбутин; 4 - кафтаровая кислота; 5 - галловая кислота; 6 - салицин; 9 - кофейная кислота; 11 - салидрозид; 12 - 4-кофеоилхинная кислота; 17 - рутин; 18 - 5-кофеоилхинная кислота; 19 - гиперозид; 20 - изокверцетин; 20а - лютеолин-7-глюкозид; 21 - изокверцитрин; 21а - авикулярин; 26 - мирице- тин; 35 - лютеолин; 37 - кверцетин; 39 - апигенин; 40 - кемпферол. По горизонтали - 1:_я (время удерживания), мин, по вертикали - абсорбция, мВ

Табл. 1

Влияние дефолиации березы повислой непарным шелкопрядом на состав и содержание химических соединений в листьях

Различия статистически недостоверны.

Более информативен анализ изменений содержания соединений в листьях дефолиированных древостоев у идентифицированных нами химических соединений. Из всех фракций нами было идентифицировано 20 соединений. Как показали результаты, у 55% этих соединений их содержание возрастало, у 40% - снижалось, у 5% не изменялось (табл. 1). В состав химических соединений, содержание которых заметно увеличивалось вследствие воздействия фактора дефолиации, входят фенолгликозиды (арбутин (увеличение концентрации на 18.85%), салицин (на 59.95%)), которые, как известно, служат факторами детерминации индуцированной энтоморезистентности [28]; флавоноиды (изокверцит- рин (на 42.83%), лютеолин (на 135.62%), кверцетин (на 9.002%), апигенин (на 74.33%), мирицетин (на 62.34%), кемпферол (на 73.78%)), гидроксикарбоновые (галловая кислота (на 116.11%)) и гидроксикоричные кислоты (кафтаровая кислота (на 18.59%)); витамины (аскорбиновая кислота (на 145.0%)). Как видно из полученных результатов, количественно в составе этой группы соединений преобладали флавоноиды. Важной их особенностью служит то, что все они проявляют как антифидантную и антидетеррентную, так и антиоксидантную активность [20, 21, 24]. Высокая антиоксидантная активность выявлена и у аскорбиновой кислоты [24].

Снижение содержания химических соединений после дефолиации листьев березы повислой отмечено у фенолгликозида: салидрозида (на 19.64%), гид- роксикоричных кислот (кофейной кислоты (на 73.0%), 5-КФК (на 63.79%)), ряда флавоноидов (рутина (на 32.23%), гиперозида (на 35.14%), лютеолин -7-глико- зида (на 108.72%), изокверцетина (на 110.70%), авикулярина (на 37.05%)). Содержание 4-КФК не изменялось.

Учитывая то, что основной целью исследований было изучение состава и содержания химических соединений при сильной дефолиации древесного яруса непарным шелкопрядом, наиболее интересны особенности реакции на этот фактор группы фенолгликозидов, которые, как отмечено выше, служат важными компонентами индуцированной энтоморезистентности. Полученные нами результаты однозначно свидетельствуют о том, что содержание салицина возрастало на 59.95%, арбутина - на 18.85%, содержание салидрозида снижалось на 16.41%. По нашему мнению, это может быть обусловлено тем, что более активная реакция на фактор дефолиации листьев может быть при более значительной степени дефолиации крон древостоев, так как береза повислая обладает достаточно высоким уровнем энтомотолерантности и при отсутствии одновременного воздействия других стрессовых факторов выдерживает сильную и полную дефолиацию даже в условиях заметного уровня антропогенного воздействия [1, 2, 19]. Другая проблема заключается в том, что воздействие фактора дефолиации сопровождается сильной активизацией процессов оксидативного стресса [29]. Учитывая то, что большинство флавоноидов, витамины и часть гидроксикоричных кислот обладают антиоксидантной активностью [24, 30] возрастание содержания этих соединений, очевидно, отражает проявление как антифидантных свойств, так и антиоксидантной активности.