Таблица 1
Влияние солей металлов на желатинолитическую активность (мм2 зон лизиса) при различной величине рН гомогенатов мицелия глубинной культуры вешенки (п=8)
|
Концентрация солей, М |
БеСЬ |
Си804 |
С0СІ2 |
2и804 |
N1804 |
|
|
активность |
при рН 5,8 |
|||||
|
Контроль |
262,5 ± 8,1 |
233,6 ± 5,2 |
186,2 ± 3,4 |
210,4 ± 3,8 |
180,8 ± 5,5 |
|
|
10-2 |
247,5 ± 7,5 |
206,5 ± 4,9* |
137,4 ± 5,5* |
240,5 ±10,3* |
167,7 ± 6,0 |
|
|
10-3 |
233,9 ± 12,7 |
224,5 ± 3,7 |
155,1 ± 4,9* |
214,6 ± 10,7 |
148,1 ± 4,4* |
|
|
10-4 |
210,8 ± 7,5* |
168,3 ± 7,1* |
181,4 ± 8,5 |
244,1 ± 9,4* |
165,3 ± 7,2 |
|
|
10-5 |
234,8 ± 10,1 |
256,7 ± 5,0 |
139,5 ± 3,2* |
241,6 ±10,5* |
137,3 ±7,03* |
|
|
10-6 |
227,8 ±10,6* |
251,6 ± 12,0 |
154,1 ± 6,3* |
210,4 ± 6,4 |
180,0 ± 5,9 |
|
|
10-7 |
224,4 ± 8,6* |
198,4 ± 5,8* |
152,8 ± 4,4* |
207,7 ± 9,2 |
138,1 ± 6,5* |
|
|
10-8 |
202,1 ± 7,7* |
177,0 ± 7,2* |
162,2 ± 7,7* |
183,1 ± 6,7* |
127,2 ± 6,3* |
|
|
активность |
при рН 7,6 |
|||||
|
Контроль |
145,1 ± 2,7 |
121,1 ± 2,6 |
147,5 ± 6,4 |
115,4 ± 3,1 |
177,8 ± 4,6 |
|
|
10-2 |
149,8 ± 26,0 |
137,8 ± 7,3* |
183,8 ±10,2* |
126,1 ± 6,6* |
244,0 ± 4,5* |
|
|
10-3 |
215,0 ±13,1* |
152,0 ± 3,6* |
193,1 ± 2,7* |
132,7 ± 4,6* |
164,2 ± 6,8 |
|
|
10-4 |
161,2 ± 6,8* |
202,1 ± 5,3* |
148,4 ± 2,7 |
119,2 ± 4,4 |
130,8 ± 2,5* |
|
|
10-5 |
154,4 ± 3,7 |
158,6 ± 7,2* |
139,5 ± 3,9 |
128,8 ± 6,9* |
138,4 ± 5,4* |
|
|
10-6 |
164,2 ±10,0* |
151,5 ± 3,8* |
69,0 ± 2,8* |
126,0 ± 5,6* |
187,1 ± 6,3 |
|
|
10-7 |
124,1 ± 4,4* |
196,4 ± 3,7* |
172,8 ± 7,8* |
136,5 ± 7,3* |
166,7 ± 9,7 |
|
|
10-8 |
144,5 ± 5,9 |
159,8 ± 4,5* |
137,8 ± 8,9 |
141,3 ± 4,2* |
171,6 ± 2,9 |
|
|
активность |
при рН 9,2 |
|||||
|
Контроль |
87,4 ± 4,3 |
43,87 ± 1,9 |
67,94 ± 3,1 |
74,4 ± 2,9 |
59,9 ± 2,8 |
|
|
10-2 |
70,8 ± 3,3* |
48,68 ± 2,9 |
71,16 ± 3,6 |
64,5 ± 2,6* |
72,9 ± 2,5* |
|
|
10-3 |
83,3 ± 3,4 |
56,36 ± 2,4* |
56,50 ± 2,1* |
62,1 ± 3,1* |
67,7 ± 3,0* |
|
|
10-4 |
66,5 ± 2,9* |
68,94 ± 3,8* |
60,16 ± 1,8 |
86,3 ± 4,2* |
74,1 ± 2,7* |
|
|
10-5 |
71,9 ± 2,9* |
55,21 ± 2,6* |
70,50 ± 2,5 |
67,0 ± 3,7 |
62,7 ± 2,6 |
|
|
10-6 |
73,8 ± 3,3* |
55,00 ± 3,4* |
56,87 ± 2,0* |
77,9 ± 4,6 |
64,1 ± 2,7 |
|
|
10-7 |
68,9 ± 10,1* |
65,16 ± 3,1* |
58,28 ± 1,7* |
71,2 ± 1,7 |
68,0 ± 3,0* |
|
|
10-8 |
84,1 ± 4,0 |
66,57 ± 3,0* |
68,96 ± 2,9 |
70,5 ± 3,4 |
75,8 ± 3,4* |
Примечание -*Здесь и далее изменения статистически достоверны при р < 0,05
Отличалось от описанного для рН 5,8 действие СоС12 и №804. Угнетение желатинолитической активности при добавлении хлорида кобальта проявилось сильнее, чем в кислой среде при концентрации СоС12 10-6 М - 53%. В то же время при двух максимальных концентрациях этого эффектора желатинолиз возрастал на 25 и 31% соответственно. Максимальный же активаторный эффект сульфата никеля проявился при его концентрации 10-2 М и достигал 137%, тогда как при концентрациях 10-4 и 10-5 М выявлено угнетение протеолиза на 26 и 22% соответственно. Примечательно, что при рН 7,6 и сульфат цинка в минимальной концентрации вызвал повышение протеолитической активности на 22%.
Отличительной особенностью действия использованных солей металлов на расщепление желатина мицелиальными протеиназами Р. ostreatus при рН 9,2 явилось слабое ингибиторное действие СоС12 и 2и804, не превысившее 16% (таблица 1, рисунок 1в).
Рисунок 1 Влияние ГвС13 (1), Си804 (2), СоС12 (3), ZnSO4 (4), N№04 (5) на желатинолитическую активность (% к контролю, принятому за 100%) при рН 5,8 (а), 7,6 (б) и 9,2 (в) гомогената мицелия глубинной культуры вешенки
Влияние сульфата никеля выразилось в активации желатинолиза, но по величине эффекта не превосходило таковое для описанных процессов при рН 5,8 и 7,6, причем концентрационная зависимость эффекта также имела сложный характер. Ингибиторное действие хлорида железа было довольно слабым и лишь при его концентрациях 10-4 и 10-7 М угнетение составило 24 и 21% соответственно. При этом значении рН также, как и при рН 7,6, четкое активаторное действие практически во всем концентрационном диапазоне оказал Си804. А при концентрациях 10-4 и 10-8 М усиление желатинолитической активности достигало 157 и 152% по отношению к контролю соответственно.
Но в целом, эти материалы свидетельствуют о довольно умеренном и слабом эффекте (причем в целом ряде случаев ингибиторном) изучаемых солей металлов на желатинолитическую активность протеиназ мицелия.
Данная картина существенно отличается от той, которую мы наблюдали при действии этих же эффекторов на желатинолитическую активность экстрацеллюлярных протеиназ мицелиальной культуры вешенки [5].
Так, при рН 7,6 рост желатинолитической активности при добавлении СоС12, 2п804 и Кі804 в концентрации 10-8 и 10-5 М достигал в сравнении с контролем 1,51-1,83 и 1,702,00 раз соответственно. С дальнейшим ростом концентрации эффект возрастал в 2,032,10 раз. Увеличение же активности при добавлении 10-2 М БеС13 не превысило 70% в сравнении с контролем. Однако оно было большим, чем в случае интрацеллюлярных протеиназ. Менее демонстративным был эффект Си804: лишь в минимальной концентрации соли рост активности составил 51%, а увеличение ее концентрации снижало эффект, и уже при концентрации 10^ М он не превысил 23%. В реакционной системе при рН 5,8 добавление №804 во всем диапазоне концентраций сопровождалось приростом активности на 77-102%. Более заметным было и влияние Си804: в диапазоне концентраций 10-8-10-3 М желатинолиз усиливался на 42-60%. При добавлении же БеС13 в минимальной концентрации выявлен рост активности протеиназ на 66%, а в присутствии СоС12 во всем диапазоне концентраций желатинолитическая активность возрастала на 6098%. Менее сильным, в сравнении с рН 7,6, был и эффект 2и804, не превысивший 66%.
Столь сильные различия можно было бы связать с уровнем растворимых белков в гомогенате мицелия вешенки 1,01 ± 0,0002 мг/г и в культуральной жидкости - 0,01 ± 0,0001 мг/мл (п=6). Однако проведенные дополнительно исследования упомянутых солей металлов на желатинолитическую активность экстрацеллюлярных протеиназ культуры гриба при 9,2 показали, что наиболее выраженным было воздействие СоС12, добавление которого в концентрациях 10-8, 10-7 и 10-3 М сопровождалось умеренным ростом желатинолитической активности на 38, 23 и 28% соответственно (таблица 2, рисунок 2). Во всех остальных случаях эффект солей (как правило, активаторный) не превышал 18%.
Таблица 2
Влияние солей металлов на желатинолитическую активность (мм2 зон лизиса) при рН 9,2 культуральной жидкости глубинной культуры вешенки (п=8)
|
Концентрация солей, М |
БеСЬ |
Си804 |
С0СІ2 |
2и804 |
№804 |
|
|
Контроль |
80,75 ± 3,57 |
80,51 ± 3,62 |
63,00 ± 2.87 |
70,75 ± 1,84 |
86,25 ± 4,10 |
|
|
10-2 |
85,42 ± 3,11 |
90,87 ± 5,77 |
72,58 ± 3,4* |
81,94 ± 3,62* |
89,87 ± 2,71 |
|
|
10-3 |
75,75 ± 3,64 |
93,87 ± 3,62* |
80,57 ± 3,1* |
71,25 ± 2,99 |
98,37 ± 4,77* |
|
|
10-4 |
80,37 ± 3,68 |
78,00 ± 2,90 |
64,93 ± 4,62* |
67,75 ± 3,19 |
91,37 ± 2,61 |
|
|
10-5 |
90,31 ± 3,15 |
84,93 ± 3,73 |
68,06 ± 3,50 |
72,33 ± 3,64 |
85,75 ± 2,56 |
|
|
10-6 |
79,16 ± 3,89 |
71,00 ± 3,00 |
65,83 ± 3,26 |
79,28 ± 3,46 |
82,16 ± 4,01 |
|
|
10-7 |
80,12 ± 3,97 |
77,31 ± 3,60 |
77,75 ± 2,27* |
57,37 ± 2,75* |
80,12 ± 2,56 |
|
|
10-8 |
84,12 ± 3,96 |
85,12 ± 4,13 |
87,08 ± 3,54* |
70,69 ± 2,88 |
73,37 ± 3,45* |
Как было установлено, желатинолитическая активность протеиназ мицелия при рН 5,8 и 7,6 угнеталась о-фенантролином на 61 и 33% соответственно, а при рН 5,8 - дополнительно и ЭДТА на 35% [1]. Однако при рН 5,8 ни одна из использованных в эксперименте солей не сопровождалась существенным увеличением протеолитической активности.
Рисунок 2 Влияние ГвС13 (1), Си804 (2), СоС12 (3), ZnSO4 (4), N№04 (5) на желатинолитическую активность (% к контролю, принятому за 100%) при рН 9,2 культуральной жидкости глубинной культуры вешенки
Складывается впечатление, что в состав подобной протеиназы входит иной металл. Вместе с тем, при рН 7,6 активаторное действие выявлено со стороны FeCl3, CuSO4 и даже CoCl2 и NiSO4 при определенных концентрациях. Но особое внимание привлекает активность желатиназ при рН 9,2, индифферентная ко всем использованным нами группоспецифическим ингибиторам протеиназ [1]. Желатинолитическая активность протеиназ этого типа, как установлено в настоящем исследовании, существенно повышалась в присутствии сульфата меди.
Заключение
Полученные результаты настоящего исследования пока дают только дополнительные факты для анализа функциональной специфики протеиназ мицелиальной культуры вешенки. Тем не менее, отдельные результаты «вырисовывают» несколько необычных черт этих протеиназ. В дальнейшем совершенно логично предстоит выяснить, что за компонент присутствует в протеиназе с оптимальным рН при 5,8, активность которой чувствительна к ЭДТА и фенантролину, но, по-видимому, не является ни одним из катионов, входящих в состав использованных в эксперименте солей. Не исключено также, что подобная особенность может быть обусловлена характером лигандного окружения катиона в макромолекуле протеиназы. Не менее примечательна и картина, полученная при исследовании резистентной к действию всех использованных ранее нами группоспецифических протеиназ (рН оптимум - 9,2), повышающая активность при добавлении сульфата меди.
Список литературы
1. Кульгавеня, А. Д. Протеолитическая активность мицелиальной культуры гриба вешенка обыкновенная (Pleurotus ostreatus) при глубинном культивировании / А. Д. Кульгавеня, В. Н. Никандров // Весн. Палес. дзярж. ун-та. Сер. прыродазна. навук. 2020. № 1. С. 12-23.
2. Ritala, A. Single cell protein - state-of-the-art, industrial landscape and patents 2001-2016 / A. Ritala, S.T. Hдkkinen, M. Toivari, M.G. Wiebe // Frontiers in Microbiol. 2017. Vol. B. art. 2009. P. 1-18.
3. Кульгавеня, А. Д. О протеиназах вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus) / А. Д. Кульгавеня, И. А. Ильючик, В. Н. Никандров // Сб. материалов V междунар. науч.практ. конф. online-offline «Биотехнология: достижения и перспективы развития», Пинск, 2021. С. 29-32.
4. Никандров, В. Н. Влияние ионов Mn (II) на расщепление протеинов-субстратов протеиназами / В. Н. Никандров, И. А. Ильючик // Новости медико-биол. наук. 2020. Т. 20, - № 4. С. 62-70.
5. Корнейчук, П. В. Влияние катионов металлов на желатинолитическую активность экстрацеллюлярных протеиназ вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus) / П. В. Корнейчук, А. Д. Кульгавеня, В. Н. Никандров // Физико-химическая биология: материалы IX междунар. науч. интернетконф. / Ставроп. гос. мед. ун-т ; отв. ред.: И. Кошель. Ставрополь: Изд-во СтГМУ, 2021. C. 8-11.
6. Корнейчук, П. В. О способности мицелиальной культуры Pleurotus ostreatus продуцировать ингибиторы протеолиза / П. В. Корнейчук [и др.] // Биотехнология: взгляд в будущее: материалы VII междунар. научно-практ. конф., 2 апреля 2021 года [в 2 ч.] / Ставроп. гос. мед. ун-т ; отв. ред.: В.Н. Мажаров. Ставрополь: Изд-во СтГМУ, 2021. Ч. 1. С.121-123.
7. Никандров, В. Н. Методы исследования протеолиза. Глава 5 / В. Н. Никандров, Н. Пыжова // Современные проблемы биохимии. Методы исследований. Минск: Выш. шк. 2013. С. 132-157.
8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.
References
1. Kul'gavenya, A.D., Nikandrov V.N. Proteoliticheskaya aktivnost' micelial'noj kul'tury griba veshenka obyknovennaya (Pleurotus ostreatus) pri glubinnom kul'tivirovanii [Proteolytic activity of fungus Pleurotus ostreatus mycelial culture in deep-liquid cultivation]. Vesnik Paleskaga dzyarzhaynaga universiteta. Seryya pryrodaznaychyh navuk nauk [Bulletin of Polessky State University. Series in Natural Sciences], 2020, no 1, рр. 12-23. (In Russian)
2. Ritala A., Hдkkinen S.T., Toivari M., Wiebe M.G Single cell protein - state-of-the-art, industrial landscape and patents 2001-2016: Frontiers in Microbiol, 2017, Vol. B. art. 2009, pp. 1-18.
3. Kul'gavenya A.D., Il'yuchik I.A., Nikandrov V.N. O proteinazah veshenki obyknovennoj (Pleurotus ostreatus) [About proteinases of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus)]. Sbornik materialov V mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii onlineoffline «Biotekhnologiya: dostizheniya i perspektivy razvitiya». Pinsk, 2021, pp. 29-32. (In Russian)
4. Nikandrov, V. N., Il'yuchik I. A. Vliyanie ionov Mn (II) na rasshcheplenie proteinovsubstratov proteinazami [Effect of Mn (II) ions on cleavage of protein substrates by proteinases]. Novosti mediko-biol. Nauk [News of biomedical sciences], 2020, vol. 20, no. 4, pp. 62-70. (In Russian)
5. Kornejchuk P. V., Kul'gavenya A. D., Nikandrov V. N. Vliyanie kationov metallov na zhelatinoliticheskuyu aktivnost' ekstracellyulyarnyh proteinaz veshenki obyknovennoj (Pleurotus ostreatus) [The influence of metal cations on the gelatinolytic activity of extracellular proteinases of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus)]. Fiziko-himicheskaya biologiya: materialy IX mezhdunarodnoj nauchnoj internet-konferencii / Stavropol'skij gosudarstvennyj medicinskij universitet Ministerstva zdravoohraneniya Rossijskoj Federacii; otv. red.: V. I. Koshel', Stavropol', 2021. - pp. 8-11. (In Russian)
6. Kornejchuk P. V., Kul'gavenya A.D., Il'yuchik I.A., Nikandrov V.N. O sposobnosti micelial'noj kul'tury Pleurotus ostreatus producirovat' ingibitory proteoliza [On the ability of Pleurotus ostreatus mycelial culture to produce proteolysis inhibitors]. Biotekhnologiya: vzglyad v budushchee. Mater. VII mezhdunar. nauchno-prakt. konf.», Stavropol'. - 2021. - Part 1. - pp. 121-123. (In Russian)
7. Nikandrov V.N., Pyizhova N.S. Metodyi issledovaniya proteoliza. Glava 5. [Methods for the study of proteolysis. Chapter 5]. Sovremennyie problemyi biohimii. Metodyi issledovaniy [Modern problems of biochemistry. Research methods]. Minsk: Visheyshaya shkola, 2013, pp. 132-157. (In Russian)
8. Bradford M.M. A rapid and sensitive me thodfor the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding: Anal. Biochem, 1976, Vol. 72, pp. 248-254.