ВЛИЯНИЕ FeCl3, CuSO4, CoCh, ZnSO4 И NiSO4 НА ЖЕЛАТИНОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПРОТЕИНАЗ МИЦЕЛИАЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ ВЕШЕНКИ ОБЫКНОВЕННОЙ (PLEUROTUS OSTREATUS)
И.А. ИЛЬЮЧИК, В.Н. НИКАНДРОВ,
А.Д. КУЛЬГАВЕНЯ, М.В. ТОРЧИЛО,
Д.Д. БЕЛЕВИЧ, А.Л. КОЗЛОВА-КОЗЫРЕВСКАЯ
Аннотация
Изучено влияние FeCl3, CuSO4, CoCl2, ZnSO4 и NiSO4 в концентрации 10-8-10-2 М на желатинолитическую активность внутриклеточных протеиназ 14-ти суточной мицелиальной культуры Pleurotus ostreatus. При рН 5,8 все соли угнетали активность в пределах 30%. Лишь сульфат цинка в нескольких концентрациях способствовал слабому росту активности протеиназ: до 16%.
Для желатинолитической активности при рН 7,6 характерен активаторный эффект сульфата меди во всем диапазоне концентраций достигавший 25-67%. Желатинолитическая активность при добавлении хлорида кобальта угнеталась сильнее, чем в кислой среде при концентрации CoCl2 10-6Мна 53%. В то же время при двух максимальных концентрациях этого эффектора желатинолиз возрастал на 25 и 31%. Максимальный активаторный эффект сульфата никеля проявился при концентрации 10Г2Ми достигал 137%, тогда как при концентрациях 10-4 и 10-5Мпротеолиз подавлялся на 26 и 22%.
При рН 9,2 четкое активаторное действие (до 157% по отношению к контролю) практически во всем концентрационном диапазоне оказал CuSO4. Эффект остальных солей не превышал 24%. Ключевые слова: желатинолитические внутриклеточные протеиназы, мицелиальная культура гриба, влияние FeCl3, CuSO4, CoCl2, ZnSO4, NiSO4.
Annotation
FeCls, CuSO4, C0CI2, ZnSO4 AND NiSO4 EFFECT ON A GELATINOLYTIC ACTIVITY OF PROTEINASES OF PLEUROTUS OSTREATUS MYCELIAL CULTURE
ILYUCHYK I.A, NIKANDROV V.N., KULGAVENYA A.D,TORCHILO M.V., BELEVICH D.D., KOZLOVA-KOZYREVSKAYA A.L.
The effect of FeCl3, CuSO4, CoCl2, ZnSO4 and NiSO4 at a concentration of 10^8-10-2 M on the gelatinolytic activity of intracellular proteinases from in 14 days mycelial culture of Pleurotus ostreatus was studied. At pH 5.8, all salts inhibited activity within 30%. Only zinc sulfate in several concentrations contributed to a weak increase in proteinase activity: up to 16%.
The gelatinolytic activity at pH 7.6 is characterized by the activating effect of copper sulfate in the entire range of concentrations, reaching 25-67%. The gelatinolytic activity upon the addition of cobalt chloride was suppressed more strongly than in an acidic medium at a CoCl2 concentration of 10-6M, by 53%. At the same time, at two maximum concentrations of this effector, gelatinolysis increased by 25 and 31%.
The maximum activator effect of nickel sulfate manifested itself at a concentration of 10-2 M and reached 137%, while at concentrations of 10-- and 10-5M, proteolysis was suppressed by 26 and 22%.
At pH 9.2, CuSO4 had a clear activating effect (up to 157% relative to control) in almost the entire concentration range. The effect of other salts did not exceed 24%.
Keywords: gelatinolytic intracellular proteases, fungal mycelium culture, effect of FeCl3, CuSO4, CoCl2, ZnSO4, NiSO4
Введение
Согласно прогностическим данным, к 2050 году человечеству потребуется ежегодно 1,250 млн тонн мяса и молочных продуктов [цит. по 1]. Дефицит белков в рационах населения и сельскохозяйственных животных настоятельно диктует необходимость изыскания альтернативных источников белка. Одним из таковых являются грибы, содержащие 30-50% белков с аминокислотным составом, сопоставимым с рекомендациями ФАО (FAO). Грибы также достаточно богаты витаминами, в первую очередь группы В, и целым рядом других биологически активных соединений [2].
К числу таких грибов относится вешенка обыкновенная - Pleurotus ostreatus, занимающая по объему выращивания в мире третье место среди грибов.
В качестве белковой добавки в рационы скота перспективно использование мицелия этого гриба, что ставит проблему эффективного глубинного культивирования его мицелия. А интенсификация глубинного культивирования выдвигает на первый план уяснение биологии продуцента и механизмов регуляции его метаболизма. К числу важнейших механизмов регуляции жизнедеятельности практически всех живых организмов относятся реакции протеолиза.
Между тем, проведенный анализ данных мировой литературы о состоянии исследований набора протеиназ P. ostreatus продемонстрировал наличие весьма немногочисленных публикаций о протеолитическом потенциале указанного гриба [3], тем более что набор протеиназ существенно зависит от состава питательной среды и условий культивирования.
В предыдущих исследованиях нами было показано, что мицелиальная культура упомянутого гриба наделена достаточно активным и разнообразным, судя по данным ингибиторного анализа, арсеналом протеиназ [1].
Следует отметить, что экстрацеллюлярные протеиназы выполняют функцию, скорее всего, обеспечения мицелия источниками питания - аминокислотами и малыми пептидами. В то же время функция внутриклеточных протеиназ довольно сложна и, в большей степени (если не всецело), играет важную роль в регуляции внутриклеточных процессов метаболизма и физиологии мицелия. Это выдвигает следующую масштабную задачу - раскрытие функционально-структурных свойств компонентов набора протеолитических энзимов мицелия вешенки.
Катионы металлов влияют на активность различных протеиназ - в частности, это было продемонстрировано в экспериментах с хлоридом марганца [4], к тому же ряд пептидогидролаз являются металлоэнзимами.
Поэтому первым шагом в данном направлении было показано, что БеС13, Си804, СоС12, 2и804 и №804 в концентрации 10"8-10" 2 М вызвали, как правило, увеличение желатинолитической активности экстрацеллюлярных протеиназ мицелиальной культуры вешенки при рН 7,6 и 5,8 [5]. Был получен неожиданный эффект перечисленных выше солей металлов - рост желатинолической активности, проявлявшийся даже при их максимальной концентрации эффекторов.
Цель настоящей статьи - выявить специфику влияния катионов металлов на желатинолитическую активность, прежде всего, ряда внутриклеточных протеиназ мицелиальной культуры вешенки, а также экстрацеллюлярной протеиназы, активной при рН 9,2.
Материалы и методы
протеиназа желатинолитический pleurotus ostreatus
Исследования проведены на «диком» штамме Pleurotus ostreatus, выделенном кандидатом биологических наук Е.О. Юрченко в 2014 г. из плодовых тел, растущих на культурном тополе (Populus sp.) в г. Минске.
В работе использовали бактоагар (Melford, USA), желатин (Fluka, Germany). Остальные реактивы были квалификации «хч» производства стран СНГ.
Гриб культивировали на картофельносахарозной среде в течение 14 дней. Подробно культивирование мицелия вешенки описано в предыдущих статьях [1, 6].
По окончании культивирования отбирали пробы культуральной жидкости (1 мл) и мицелия вешенки. Биомассу гриба отмывали, максимально просушивали на фильтровальной бумаге, навески по 0,5 г гомогенизировали при 4° С в течение 2 мин в 1 мл бидистилированной воды, центрифугировали в течение 10 мин при 4 °С и 8000 об/мин. Осветленный гомогенат использовали для дальнейших исследований. Культуральную жидкость использовали без дополнительного разведения.
В качестве растворителя при приготовлении белок-агаровых пластин использовали 0,15 М раствор NaCl рН 7,4. К исследуемым образцам культуральной жидкости или гомогената мицелия вешенки добавляли 0,2 M ацетатный буфер рН 5,8 или 0,05 M трис-HCl буфер рН 7,6, или 0,1 М боратный буфер рН 9,2, учитывая рН-зависимость желатинолитических протеиназ гриба [1].
Водные растворы FeCl3, CuSO4, CoCl2, ZnSO4 и NiSO4 добавляли к образцам культуральной жидкости или гомогенатов мицелия вешенки до конечной концентрации 10-8-10-2 М.
Протеолитическую активность определяли по расщеплению желатина в тонком слое агарового геля как подробно описано ранее [7]. Объем наносимых образцов составлял 10 мкл, объем растворов солей - 10 мкл.
Количество белка в образцах определяли колориметрическим методом [8].
Все исследования проведены не менее чем восьмикратно, результаты обработаны статистически с использованием программ ^їаїШіса 6.0 по 1-критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение
На желатинолитическую активность мицелиальных (интраклеточных) протеиназ Р. ostreatus при различных значениях рН использованные соли металлов оказали неодинаковое действие.
Для протеолиза желатина при рН 5,8 был, в частности, характерен эффект угнетения активности, однако он не превышал 30% (таблица 1, рисунок 1а). Примечательно, что хлорид железа, сульфаты меди и никеля вызвали подобное действие при минимальных концентрациях в реакционной системе. Дополнительно снижение активности было выявлено также при добавлении Си804 и №804 в концентрациях 10-4 и 10-5 М соответственно. В отличие от этого ингибиторное влияние СоС12 проявилось при концентрациях 10-2 и 10-5 М. Эффект же остальных использованных солей при их максимальной концентрации был невелик. И лишь сульфат цинка в нескольких концентрациях способствовал росту желатинолитической активности протеиназ, но не более чем на 16%.
Воздействие избранных нами эффекторов на желатинолитическую активность мицелиальных протеиназ Р. ostreatus при рН 7,6, на наш взгляд, заметно отличалось от описанного для рН 5,8. Здесь был характерен активаторный эффект сульфата меди, проявившийся во всем диапазоне концентраций, а при концентрации 10-3-10-8 М достигавший 2567% с максимумом эффекта роста при 10-4 и 10-7 М: 66,9 и 62,2% соответственно (таблица 1, рисунок 1б). Увеличение желатинолитической активности вызвал и хлорид железа, причем ее рост на 48% наблюдался при концентрации этой соли 10-3 М.