Автореферат: Вирулентные свойства стафилококковой микрофлоры кожи при атопическом дерматите

* Различие с ПЗЛ статистически значимо (p<0,05).

Преимущественная колонизация кожи при АтД видом Staphylococcus aureus обусловлена, прежде всего, протеолитической инактивацией протеазами бактерицидного действия антимикробных пептидов кожи (LL-37). Нами были получены статистически значимые различия в активности протеиназ между штаммами стафилококка, выделенными от пациентов с АтД и ПЗЛ - (1,40,21 и 0,360,08, соответственно, p<0,01). Эти различия носили у Staphylococcus aureus внутривидовой характер (рисунок 1).

Рисунок 1 - Протеиназная активность штаммов стафилококков, колонизирующих кожу больных атопическим дерматитом

Установлено, что протеиназная активность штаммов Staphylococcus aureus, колонизирующих кожу больных АтД, превышала эту активность почти в 4 раза у штаммов данного вида, выделенных от практически здоровых лиц (1,550,36 и 0,420,09 соответственно, p<0,02), что свидетельствует о различной степени вирулентности штаммов, колонизирующих кожу в норме и при патологии. С помощью ингибиторов протеиназ определяли два профиля Ig-протеиназ по типу активных центров.

Таблица 3 - Профиль протеиназ (по типу активных центров) стафилококков кожи пациентов с атопическим дерматитом

Примечание: «+»- наличие активности Ig-протеиназ данного типа ; «»- отсутствие активности Ig-протеиназ данного типа у всех исследованных штаммов.

Определение профиля протеиназ по типу активных центров у Staphylococccus aureus, колонизирующих кожу больных АтД и ПЗЛ, показало, что энзимы, образуемые этими штаммами, относятся к металлозависимым и сериновым протеиназам. У вида Staphylococcus epidermidis преимущественно активность обеспечивалась за счет сериновых протеиназ (таблица 3).

Полученные нами данные о степени протеиназной активности штаммов Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, колонизирующих кожу в норме и при АтД, а также данные о видовом различии в профиле протеиназ (по типу активных центров) согласуются с работами исследователей, установивших, что протеолиз кателицидинов LL-37 сериновыми протеазами, секретируемыми Staphylococcus epidermidis, на фрагменты, не теряющие антимикробные свойства, позволяет данному виду конкурировать за данную экологическую нишу; в то время как металлопротеиназа Staphylococcus aureus расщепляет пептид LL-37 на фрагменты, не обладающие противомикробным действием и, тем самым, разрушает врожденную противомикробную систему защиты кожи.

Анализ ДНК-азной активности - значимого маркера патогенности штаммов Staphylococcus, показал, что ДНК-азоположительные штаммы стафилококков высеваются с кожи больных АтД в 91,2 % случаев, а ДНК-азоотрицательные - в 8,8 % случаев. Установлено, что при тяжелом варианте течения АтД у детей первых двух лет все выделенные штаммы Staphylococcus aureus с кожи пациентов были способны образовывать ДНК-азы, тогда как при легкой степени тяжести АтД кожа колонизируется ДНК-азоположительными штаммами в 71,0 % случаев. Такая высокая частота встречаемости ДНК-азной активности среди штаммов Staphylococcus aureus может служить характерным фенотипическим маркёром персистенции на коже штаммов этого вида у пациентов с атопическим дерматитом. Выявлено, что уровень активности термонуклеазы у штаммов стафилококков, колонизирующих кожу больных АтД, в 1,24 раза выше, чем у штаммов стафилококков, заселяющих кожу практически здоровых лиц.

Известно, что реактивные формы кислорода (O2- , OH•) и перекись водорода (H2O2) оказывают токсическое действие на микробные клетки, но вирулентные виды микроорганизмов эволюционно выработали систему ферментативной защиты (каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза и др.) от окислительного киллинга в фагоцитах. Наши исследования показали, что в период обострения АтД кожа пациентов колонизируется штаммами стафилококков, для которых характерна высокая активность каталазы и супероксиддисмутазы (СОД), по сравнению со штаммами, выделяемыми с кожи в период ремиссии заболевания (таблицы 4 и 5). Выявленная закономерность не зависела от видовой принадлежности стафилококков. Анализ уровня активности каталазы у штаммов Staphylococcus aureus, Staphylococcus еpidermidis, колонизирующих кожу пациентов с различной степенью тяжестью АтД и ПЗЛ, выявил статистически значимые различия в уровне активности этого фермента. Активность СОД у штаммов Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, выделенных с кожи пациентов с различной тяжестью АтД, также была статистически значимо более высокой, чем активность этого фермента у штаммов этих видов, колонизирующих кожу практически здоровых лиц.

Таблица 4 -Активность основных антиоксидантных ферментов у штаммов Staphylococcus epidermidis, выделенных с кожи больных атопическим дерматитом в различные периоды заболевания

* - Различия в среднем уровне активности у штаммов, полученных в разные периоды заболевания, статистически значимы (p<0,05).

Таблица 5 - Активность основных антиоксидантных ферментов у штаммов Staphylococcus aureus, выделенных с кожи пациентов с атопическим дерматитом в различные периоды заболевания

* - Различия в среднем уровне активности между штаммами, полученными в разные периоды заболевания, статистически значимы (p<0,05).

Выраженная активность ферментов каталазы и супероксиддисмутазы у штаммов стафилококов, составляющих бактериоценоз кожи, по-видимому, позволяют этим бактериям колонизировать среду, богатую кислородом, а также противостоять кислородзависимому киллингу, реализуемому в фагоцитах макроорганизма. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что при атопическом дерматите кожа колонизируется штаммами стафилококка, максимально адаптированными к окислительному киллингу при фагоцитозе и внешним аэробным условиям.

Таким образом, в период обострения атопического дерматита кожа пациентов колонизируется штаммами стафилококков с выраженными адгезивными свойствами, высокой активностью ферментов распространения (протеиназы и термонуклеазы) и ферментов антиоксидантной защиты (каталазы и супероксиддисмутазы), по сравнению со штаммами, составляющими бактериоценоз кожи в норме.

Эффективность пиритиона цинка при местной терапии атопического дерматита и его антибактериальная активность в отношении штаммов Staphylococcus aureus

В ряде рандомизированных исследований была показана безопасность и клиническая эффективность применения пиритиона цинка («Скин-кап», Cheminova International S.Q., Испания) в терапии больных атопическим дерматитом [Мокроносова М.А. и др., 2004; Скрипкин Ю.К. и др., 2007; Фассахов Р.С. и др., 2007].

В нашем исследовании проведена оценка эффективности местной терапии АтД с применением одной из лекарственной формы пиритиона цинка по следующим показателям: бактериологическим (оценка элиминации, плотности колонизации кожи больных атопическим дерматитом Staphylococcus аureus, изменений вирулентных свойств штаммов стафилококков, колонизирующих кожу пациентов); и клиническим критериям эффективности (степень тяжести заболевания, динамика основных симптомов дерматита).

У всех больных до начала терапии определяли тяжесть заболевания: индекс SCORAD; индекс IGA (Investigatorґs Global Assessment) - исследовательская глобальная оценка, учитывающая выраженность местных изменений, выраженность кожного зуда и нарушения сна; а также проводили бактериологическое исследование пораженных участков кожи.

Результаты, отражающие клинические критерии эффективности проведённой терапии, с применением пиритиона цинка показали, что на 21-й день терапии у всех больных было отмечено снижение индекса тяжести заболевания (SCORAD) в 3,6 раза по сравнению с исходным уровнем (соответственно 51,20,5 и 14,20,7, p<0,05), отмечено также значительное купирование местных воспалительных изменений кожи (гиперемии, зуда, мокнутия), что сопровождалось улучшением общего самочувствия пациента. Объективные критерии положительной динамики общего состояния пациентов к 21-му дню терапии, такие как снижение в 3 раза выраженности зуда кожи, снижение значения показателя нарушения сна в 2,5 раза, уменьшение индекса IGA почти в 3 раза - (3,30,3) балла и (1,20,2) балла соответственно (p<0,05) - подтверждают клиническую эффективности трехнедельного курса терапии с применением пиритиона цинка в данных пациентов.

К 21-дню терапии у пациентов отмечается статистически значимое снижение, по сравнению с исходным уровнем, плотности колонизации поражённой кожи Staphylococcus aureus на 15 % - (4,30,2) lg КОЕ/см2 и (3,70,1) lg КОЕ/см2, соответственно (p<0,05).

Отмечено, что к концу терапии пиритионом цинка с участков поражённой кожи детей в возрасте до 5 лет выделяются штаммы Staphylococcus aureus со сниженными адгезивными свойствами (ИАС до терапии 4,60,5, после - 3,00,5 (p<0,05), по сравнению со штаммами, колонизировавшими кожу этих пациентов до терапии (рисунок 2).

Рисунок 2 - Индекс адгезивности штаммов Staphylococcus aureus до и после терапии у детей в возрасте до 5 лет

У детей в возрасте старше 5 лет к концу терапии пиритионом цинка статистически значимых различий в адгезивных свойствах между штаммами Staphylococcus аureus, выделенных как до так и после терапии, нами не было выявлено (ИАС до терапии 4,80,5, после - 4,70,5, p>0,05), (рисунок 3).

Рисунок 3 - Индекс адгезивности штаммов Staphylococcus aureus до и после терапии у группы детей в возрасте от 6 до 16 лет

Изучение ферментативных свойств у штаммов Staphylooccus аureus, выделенных с кожи до и после лечения (21-й день), показало, что к концу терапии кожа пациентов колонизировалась штаммами со сниженной ферментативной активностью, по сравнению со штаммами, выделенными до начала терапии. Установлены статистически значимые различия в удельной активности гидролитических ферментов у штаммов Staphylococcus aureus, выделяемых до и после терапии: IgG-протеиназ - в 1,5 раза, термонуклеазы - в 1,2 раза (p<0,05) (рисунки 4 и 5).

Активность антиоксидантных ферментов (каталазы и супероксиддисмутазы) у штаммов Staphylococcus aureus, выделяемых к концу терапии с кожи пациентов, получавших пиритион цинка, была также статистически значимо снижена в 1,36 и 1,48 раза соответственно, по сравнению с активностью этих ферментов у штаммов Staphylococcus aureus до терапии (рисунки 6 и 7).

Рисунок 4 - Протеиназная активность внеклеточных протеаз штаммов Staphylococus aureus, выделенных до и после лечения

Рисунок 5 - Активность термонуклеазы лизатов штаммов Staphylococcus aureus, выделенных с кожи до и после лечения

Рисунок 6 - Активность каталазы штаммов Staphylococcus aureus, выделенных до и после лечения

Рисунок 7 - Активность супероксиддисмутазы лизатов штаммов Staphylococcus aureus, выделенных до и после лечения

Таким образом, проведенные исследования показали, что использование препарата пиритиона цинка для местного лечения больных АтД дает выраженный терапевтический эффект. После курса лечения пиритионом цинка статистически значимо снижается плотность колонизации кожи золотистым стафилококком; к 21-му дню терапии с кожи больных высеваются штаммы Staphylococcus aureus cо сниженными вирулентными свойствами. Терапевтическая эффективность активированного пиритиона цинка обусловлена выявленной антистафилококковой активностью.

ВЫВОДЫ

1 У больных атопическим дерматитом бактерии Staphylococcus aureus являются значимым компонентом микрофлоры кожи. Частота выделения Staphylococcus aureus с поражённой кожи при атопическом дерматите составляет 59,5 %, против 8,0 % в группе сравнения. Частота выделения этого вида с непоражённой кожи пациентов не превышает 27,7 %.

2 У детей раннего возраста (до двух лет) с тяжелой степенью атопического дерматита отмечается наиболее выраженная степень плотности колонизации Staphylococcus aureus (lg 5,5 0,9) КОЕ/см2, что сопровождается высоким уровнем общего сывороточного иммуноглобулина E и эозинофилией.

3 При обострении атопического дерматита кожа колонизируется низко- и среднеадгезивными вариантами Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis и высокоадгезивными вариантами Staphylococcus aureus. Кожа практически здоровых лиц заселена неадгезивными и низкоадгезивными вариантами Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus еpidermidis. Установлена прямая зависимость между степенью выраженности адгезивного потенциала по индексу адгезии стафилококков для Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus от степени тяжести атопического дерматита.

4 Выявлены различия по фенотипическим свойствам, отражающим вирулентность штаммов стафилококков, колонизирующих кожу больных атопическим дерматитом и практически здоровых лиц. Активность протеиназ у штаммов Staphylococcus aureus, выделенных от пациентов, в 4,0 раза, термонуклеазы - в 1,24 раза выше, чем у штаммов этого вида стафилококка, выделенного с кожи практически здоровых лиц. Установлены статистически значимые различия в уровне активности каталазы и супероксиддисмутазы у штаммов Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, выделенных с кожи больных со среднетяжелой и тяжелой степенью атопического дерматита, и штаммов стафилококка этих же видов, колонизирующих кожу практически здоровых лиц.