Автореферат: Вирулентные свойства стафилококковой микрофлоры кожи при атопическом дерматите

Специфическая диагностика включала оценку данных аллергологического анамнеза, кожного тестирования, определение содержания общего иммуноглобулина Е (IgE) в сыворотке крови. Кожное тестирование проводили в аллергологическом кабинете на базе поликлиники ФГУН КНИИЭМ (зав. поликлиникой - к.м.н. Л.Р. Смирнова). Уровень общего IgE в сыворотке крови определяли количественным иммуноферментным методом с использованием наборов тестов производства ЗАО «БиоХимМак». Анализ аллергологического анамнеза проводили по общепринятым стандартам обследования аллергических больных.

Микробиологические методы исследования включали качественную и количественную оценку микрофлоры. Качественный состав микрофлоры кожи определяли методом агаровых мазков-отпечатков по Н. Н. Клемпарской в модификации А. Е. Максимовой (1997). Идентификацию микроорганизмов осуществляли по морфологическим, биологическим и биохимическим свойствам в соответствии с нормативными документами. Также использован количественный метод микробиологического исследования микрофлоры кожи - количество выросших колоний микроорганизмов выражали в колониеобразующих единицах на 1 см2 кожи (КОЕ/см2).

Определение ДНК-азной активности штаммов стафилококка проводили согласно приказу МЗ РФ от 22.04.1985 г. № 585 на питательной среде DNAse-Agar («Bio-RAD», Франция). Определение термонуклеазной активности штаммов бактерий рода Staphylococcus проводили методом кислоторастворимых фракций в жидкой среде культивирования по методу Н.Е. Кучеренко и соавт. (1988).

Определение чувствительности стафилококков к антимикробным препаратам и метициллинрезистентности выделенных штаммов осуществляли согласно Методическим указаниям МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности штаммов бактерий рода Staphylococcus к антибактериальным препаратам проводили диско-диффузионным методом.

Идентификацию метициллинрезистентных стафилококков осуществляли по МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» с использованием питательной среды MRSA-SELECT-агар («Bio-RAD», Франция). Для контроля качества проводимых исследований использовали эталонный штамм Staphylococcus aureus ATCC № 25923.

Активность секретируемых стафилококками протеолитических ферментов определяли в питательной среде методом фибрин-агаровых пластин [Astrup Т., 1952]. Количественно протеиназную активность оценивали in vitro иммуноферментным методом в лаборатории иммунологии и разработки аллергенов ФГУН КНИИЭМ Роспотребнадзора (зав. лаб. - старший научный сотрудник, к.м.н. Тюрин Ю.А). В качестве субстрата использовали иммуноглобулин G человека (IgG). Активность протеиназ выражали в единицах удельной активности фермента (мкмоль субстрата, расщеплённого за 1 минуту на 1 мг белка в питательной среде культивирования при оптимальных условиях). Концентрацию белка в питательной среде определяли по M. M. Bradford (1976).

Определение адгезивных свойств штаммов стафилококков проводили по методу В.И. Брилис и соавт. (1986). При этом изучение окрашенных мазков и подсчет клеток проводили в лаборатории физиологии и генетики культивируемых клеток Казанского института биохимии и биофизики КНЦ РАН с использованием цифровой камеры AxioCam MRc5 (Carl Zeiss, Германия), адаптированной к световому микроскопу «Jenamed» (Carl Zeiss, Германия) совместно с научным сотрудником, к. б. н. Акуловым А. Н.).

Активность супероксиддисмутазы (СОД) в лизатах стафилококка определяли адренохромным методом в модификации Т. В. Сирота (1999). Лизаты стафилококков получали по методу R. Merchante (1995). Удельную активность СОД оценивали на 1 мг белка, содержащегося в лизате стафилококковых клеток. Концентрацию белка определяли по M. M. Bradford (1976).

Активность каталазы бактериальных штаммов определяли по методу М.А. Королюк и соавт. (1988), выражали в мкаталах на 1 млн микробных клеток.

Cхема местной терапии больных атопическим дерматитом в возрасте от 1 года до 18 лет, включающая препараты пиритиона цинка:

- при ограниченной форме АтД использовали крем для наружного применения 0,2 % 2 раза в день (утром и вечером) на 4-6 ч до полного разрешения процесса (21 день);

- при наличии экзематизации, мокнутия, отека использовали аэрозоль для наружного применения 0,2 % 2 раза в день до полного разрешения процесса (21 день).

- при лихеноидной форме и на участки лихенизации кожи - крем для наружного применения 0,2 % 1 раз в день до полного разрешения процесса (21 день).

Статистическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере в математических пакетах программ “Statistica 6.0” StatSoft USA. Определяли среднюю арифметическую (М), стандартную ошибку средней арифметической (m). Оценку значимости различий средних арифметических проводили с использованием t-критерия Стьюдента и уровня значимости (p). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

Микробиологические особенности стафилококковой микрофлоры кожи у больных атопическим дерматитом

Вначале нами была проведена оценка прогностически неблагоприятных факторов у пациентов с атопическим дерматитом. Было установлено, что у 91,3 % пациентов заболевание чаще дебютировало на первом году жизни: у 57,0 % - в первые 3 месяца, 20,3 % - в возрасте от 3 до 6 месяцев и 14,0 % - во втором полугодии жизни, т.е. был характерен ранний дебют заболевания. У 50 (43,8 %) пациентов наблюдалось сочетание нескольких аллергических заболеваний: в 60,0 % случаев АтД сочетался с атопической бронхиальной астмой, в 10,0 % - с аллергическим ринитом и в 10,0 % - с пищевой и/или лекарственной аллергией, проявляющейся в виде ангионевротического отёка и острой крапивницы.

Оценка наследственной отягощённости по аллергическим заболеваниям у пациентов с АтД позволила выделить группы больных с высокой, средней и низкой степенью наследственной отягощенности. Высокая степень наследственной отягощённости была выявлена у 30,7 % пациентов с атопическим дерматитом. В этой группе в период клинического обострения наблюдалось тяжелое течение заболевания (индекс SCORAD - 60 баллов и выше) и выявлены статистически значимые различия в числе обострений в течение года в сравнении с группой лиц со средней и низкой степенью наследственной отягощённости. В 57,0 % случаев у пациентов с АтД наблюдалась средняя степень наследственной отягощённости, тяжесть заболевания составила от 30 до 60 баллов по SCORAD. У пациентов с АтД низкая наследственная отягощённость встречалась редко (12,3 % случаев), тяжесть заболевания при этом составляла в период обострения менее 30 баллов по SCORAD, течение заболевания характеризовалось статистически значимо меньшим числом обострений в год по сравнению с пациентами с высокой и средней степенью наследственной отягощённости по аллергическим заболеваниям (таблица 1).

Таблица 1 - Зависимость тяжести атопического дерматита от степени наследственной отягощённости по аллергическим заболеваниям

* Различие с больными с высокой и низкой степенью наследственной отягощенности статистически значимо (p<0,05).

Учитывая, что уровень IgE у детей и взрослых может быть использован для оценки выраженности сенсибилизации и определения атопического генеза заболеваний, нами было проведено исследование его содержания у больных с разной степенью тяжести атопического дерматита. Было показано, что у 38 (33,3 %) пациентов с тяжелым течением АтД (экссудативная и пруригоподобная формы) в возрасте от 6 месяцев до 2 лет отмечались максимальные уровни общего IgE - (392,018,3) МЕ/мл (p<0,05). В возрастной группе от 3 до 14 лет АтД протекал в лихеноидной и эритематосквамозной форме (средняя степень тяжести), уровень сывороточного IgE - (228,08,03) МЕ/мл - статистически значимо отличался от его уровня в младшей и старшей возрастных группах. У пациентов в возрасте от 15 до 18 лет АтД протекал в эритематосквамозной форме с лихенизацией (легкая степень тяжести), уровень общего сывороточного IgE при этом был наименьшим и составил (146,011,3) МЕ/мл (p<0,05) .

Напряжённость сенсибилизации у пациентов с АтД подтверждалась высокими значениями абсолютного и относительного содержания эозинофилов в периферической крови. Так, уровень эозинофилии был наибольшим у пациентов в возрасте до двух лет с тяжелым течением АтД, наименьший уровень эозинофилии был выявлен в старшей возрастной группе с эритематосквамозной формой АтД с выраженной лихенизацией кожи. Уровень эозинофилии периферической крови коррелировал с уровнем общего IgE (r=0,67, p<0,05).

Для оценки роли микробного фактора в развитии АтД нами были проведены микробиологические исследования в двух группах больных: в 1-й группе АтД протекал без клинических проявлений вторичной инфекции кожи (n=84); во 2-й группе наблюдались осложнения течения заболевания с присоединением местной инфекции кожи (n=30).

В первой группе частота выделения Staphylococcus aureus с поражённой кожи составила 59,5 %, с непораженной - 27,7 %, против 8,0 % в группе практически здоровых лиц. Частота встречаемости у больных Staphylococcus еpidermidis составила от 5,0 до 11,9 % (с непораженной и пораженной кожи соответственно); в контрольной группе (ПЗЛ) Staphylococcus epidermidis был обнаружен на коже у 20,0 % обследованных.

Установлено, что наиболее часто и с максимальной плотностью обсемененности Staphylococcus aureus выделялся с кожи детей в возрасте до 2 лет с экссудативной формой АтД, протекавшего с максимальной степенью тяжести в период обострения кожного процесса - (5,5±0,3) lg КОЕ/см2 против (3,3±0,4) lg КОЕ/см2 у практически здоровых лиц (p<0,05). По мере снижения тяжести течения АтД наблюдалось уменьшение частоты выделения и плостности колонизации поверхности кожи золотистым стафилококком.

Во 2-й группе пациентов (с осложненным инфекцией течением АтД) у 16 (14,0 %) пациентов (дети в возрасте от 6 мес. до 3 лет) было отмечено развитие бактериальной, у 7 (6,1 %) - микотической, обусловленной дрожжеподобными грибами рода Candida и Malassezia; и у 7 (6,1 %) больных - микст-инфекции, обусловленной ассоциацией бактериальной (Staphylococcus aureus) и грибковой микрофлорой (Candida, Malassezia). Закономерных изменений в степени колонизации поверхности кожи Staphylococcus аureus в зависимости от тяжести заболевания не выявлено.

Полученные данные согласуются с данными других исследователей, показавших четкие видовые различия в частоте встречаемости Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis в микробиоценозе коже больных АтД, характеризующих патогенетическую значимость бактерий рода стафилококков в развитии заболевания [Мокроносова М.А., 2003; Gong J. Q. et al., 2006]. При АтД без клинических проявлений инфекционного процесса на коже частота обнаружения и степень обсемененности поверхности пораженной кожи Staphylococcus aureus определяется уровнем тяжести, характером течения заболевания, обусловленными особенностями реагирования организма. Осложненные вторичной инфекцией клинические формы АтД характеризуются более тяжелым течением, что обусловлено снижением реактивности организма и развитием иммунной недостаточности у больных [Leung D. Y. M., 2002]. Различия в патогенетической роли основных видов стафилококков, колонизирующих кожу ПЗЛ и больных АтД, могут быть обусловлены особенностями вирулентных свойств этих бактерий. В связи с этим далее нами были изучены вирулентные свойства бактерий рода Staphylococcus, колонизирующих кожу больных атопическим дерматитом.

Адгезивность - способность экспрессировать факторы адгезии и колонизации является пусковым механизмом реализации патогенности бактерий. Выбор эритроцитарной модели для оценки адгезии был обусловлен тем, что эритроциты несут на своей поверхности фибронектин, фибриноген и такие компоненты гликокаликса, как гликозаминогликаны, которые создают специфические эпитопы для взаимодействия с адгезивными поверхностными протеинами стафилококка и другими факторами адгезии этих бактерий [Clarke S.R. et al., 2004]. Для оценки адгезивного потенциала применялся индекс адгезии стафилококка (ИАС) - среднее число адгезированных клеток на одном эритроците [Брилис В.И. и др., 1986]. Неадгезивными считали штаммы при среднем числе клеток на одном эритроците 1,75; низкоадгезивными - от 1,76 до 2,50; среднеадгезивными от 2,51 до 4,00 и высокоадгезивными при ИАС >4,00.

Было показано, что в период обострения заболевания с кожи пациентов выделяются гетерогенные по адгезивности стафилококки, которые условно можно разделить на низко- и среднеадгезивные варианты (ИАС от 1,78 до 3,40) видов Staphylococus aureus, Staphylococcus epidermidis (50,0 % всех выделенных штаммов) и высокоадгезивные варианты (ИАС от 4,50 до 6,00) вида Staphylococcus aureus (25,0 % штаммов). В отличие от больных АтД, с кожи ПЗЛ выделялись стафилококки (Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus epidermidis), большая часть которых (75,0 %) была отнесена к неадгезивным (ИАС от 0,6 до 1,0) и низкоадгезивным вариантам (ИАС от 1,0 до 2,0). Установлена чёткая зависимость встречаемости высоко-, средне- и низкоадгезивных вариантов Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus от тяжести течения атопического дерматита. Так, при среднетяжёлых и тяжёлых формах АтД кожа пациентов колонизировалась только высокоадгезивными штаммами Staphylococcus aureus и среднеадгезивными штаммами Staphylococcus epidermidis, при легких формах тяжести АтД выделялись низкоадгезивные и среднеадгезивные варианты Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus aureus (таблица 2).

Таблица 2 - Адгезивность стафилококков кожи пациентов с различной степенью тяжести атопического дерматита