14,75 мкг/см3 при значениях Cp от 29,52±0,05 до 6,00±0,01, соответственно (n=5, p<0,005). При концентрациях 146S компонента более 14,75 мкг/см3, по всей видимости, по причине высокого содержания полных вирусных частиц предложенная квадратичная модель не позволяла проводить достоверный опосредованный количественный анализ (n = 5, p>0,01). Определен нижний предел значения Cp, который для разработанной модели q46S ВЯ = 0,0111(Сp)2-1,0157Cp+20,446 составил 29,65.
Таблица 4
Оценка параметров валидации методики опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для вакцины при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ
|
Параметр валидации методики |
Валидационный показатель |
Значения показателей валидации методики при исследовании вируса ящура с разными концентрациями 146S компонента (мкг/см3) |
||||||
|
0,05 |
0,10 |
0,50 |
1,0 |
3,0 |
5,0 |
|||
|
специфичность |
относительная погрешность (e), % |
4-5 |
3-3,54 |
2-3,12 |
1,0-2,0 |
0,35-1,67 |
0,20-0,65 |
|
|
сходимость |
среднее квадратичное отклонение (5), % |
н/и |
0,063 |
н/и |
0,052 |
0,023 |
0,011 |
|
|
коэффициент вариации (C5), % |
н/и |
0,214 |
н/и |
0,191 |
0,099 |
0,056 |
||
|
Воспроизводи-мость |
среднее квадратичное отклонение (5), % |
н/и |
0,091 |
н/и |
0,075 |
0,062 |
0,012 |
|
|
коэффициент вариации (C5), % |
н/и |
0,306 |
н/и |
0,278 |
0,272 |
0,064 |
||
|
линейность |
коэффициент корреляции (r) |
0,9965 |
||||||
|
правильность |
степень достоверности (R2) |
0,9930 |
||||||
|
тангенс угла наклона (k) |
0,9963 |
|||||||
|
свободный член (b) |
0,0149 |
|||||||
|
Аналитическая область |
диапазон опосредованного количественного определения, мкг/см3 |
0,05-14,75 |
Примечание: н/и - не исследовали.
На заключительном этапе исследования проведена проверка линейной зависимости значения Cp и концентрации 146S компонента вируса ящура в пределах аналитической области методики, тестируя 50 вируссодержащих суспензий с концентрациями аналита от 0,05 до 14,75 мкг/см3 в пяти повторениях. В результате анализа получена квадратичная функция С1468 вя = 0,0111(Ср)2-1,0157Ср+20,446 с коэффициентом корреляции (r), равным 0,9965, что позволяет судить о достоверности результатов статистического исследования.
Заключение
Проведена оценка основных валидационных характеристик методики опосредованного концентрации 146S компонента вируса ящура при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ с применением квадратичной функции
СМ68 ВЯ = 0,0111(Ср)2-1,0157Ср+20,446 (таблица 4).
Выявлено, что диапазон применения ОТ- ПЦР-РВ составил 0,05-14,75 мкг/см3. При тестировании вируссодержащего материала с концентрациями 146S компонента от 0,05 до 5,00 мкг/см3 валидируемая методика ха- растеризуется высокой специфичностью (е составляет 0,2-5,0%), а также высокой прецизионностью в условиях сходимости, (S находилось в диапазоне 0,011-0,063%, 5<2%, С5 - 0,056-0,214%, Cs<2%) и в условиях воспроизводимости (5 составило 0,012-0,091%, S <3%, с5 - 0,064-0,306%, C5<3%).
При оценке линейности и правильности доказано, что валидируемая методика дает свободные от ошибки результаты с высоким коэффициентом корреляции (r = 0,9965, г-1) и степенью достоверности (R2 = 0,993, R2-1).
Результаты валидации ОТ-ПЦР-РВ удовлетворяют всем критериям приемлемости.
Исходя из этого, предложенная методика является достоверной и может быть использована для опосредованной количественной оценки 146S иммуногенного компонента вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
Список литературы
1. Бондаренко А.Ф. Качественный и количественный иммунохимический анализ вирусных белков. / А.Ф. Бондаренко. Суздаль, 1994. 92 с.
2. Государственная фармакопея XII изд. Ч. 1. М., 2010. С. 254-266.
3. Ланг Т.А. Как описывать статистику в медицине. Руководство для авторов, редакторов и рецензентов. / Т.А. Ланг, М. Сесик. М.: Практическая Медицина, 2011. 480 с.
4. Носырев П. ОАО «Ай Си Эн Лексредства» / П. Носырев, М. Носырева, Т Рассказова, Н. Корнеева. // Практикум по GMP. Валидация аналитических методик: теория.
5. ОФС.1.1.0012.15 Валидация аналитических методик. Фармакопея.ру.
6. Патент РФ №2619878/13, 18.05.2017. Способ определения концентрации 1468-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // 2017. Бюл. №14. Лозовой Д.А., Доронин М.И., Михалишин Д.В. [и др.].
7. Пономарев А.П. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. / А.П. Пономарев, В.Л. Узюмов, К.Н. Груздев. Владимир: Фолиант, 2006. 250 с.
8. Ререр Х. Ящур / Х. Ререр. Пер. с нем. Г.А. Сурковой; Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.В. Малярца. Москва: Колос, 1971. 432 с.
9. СТБ ИСО 5725-2002. «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений». Части 1-6. - 01.11.2002.
10. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th еd. Paris, 2018. - Ch. 3.1.8.
11. Vallat B. OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. 2nd ed. Paris, France, 2008. 67 p.