ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»
Валидация способа определения концентрации 146S иммуногенного компонента вируса ящура в вакцине при сравнении графиков второй производной для сигмоид реакции амплификации
Доронин М.И., к.б.н., с.н.с.
Михалишин Д.В., к.в.н.
Стариков В.А., к.в.н., в.н.с.
Лозовой Д.А., д.в.н., доцент
Борисов А.В., к.в.н., в.н.с.
Аннотация
В данной статье представлена оценка основных валидационных характеристик методики опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура при сравнении графиков второй производной для кривых обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) с применением квадратичной функции C146S ВЯ = 0,0111(Cp)2-1,0157Cp+20,446. Диапазон применения ОТ-ПЦР-РВ составил 0,0514,75 мкг/см3. При тестировании вируссодержащего материала с концентрациями 146S компонента от 0,05 до 5,00 мкг/см3 валидируемая методика характеризуется высокой специфичностью (е составляет 0,2-5,0%), а также высокой прецизионностью в условиях сходимости и воспроизводимости. При оценке линейности и правильности доказано, что валидируемая методика дает свободные от ошибки результаты с высоким коэффициентом корреляции (r = 0,9965, r-1) и степенью достоверности (R2 = 0,993, R2-1). Результаты валидации ОТ-ПЦР-РВ удовлетворяют всем критериям приемлемости. Исходя из этого, предложенная методика является достоверной и может быть использована для опосредованной количественной оценки 146S иммуногенного компонента вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
Ключевые слова: 146S иммуногенный компонент вируса ящура, вакцина, реакция амплификации, вторая производная, валидация
Summary
Validation of the method for determining the concentration of the 146s immunogenic component of find virus in a vaccine by comparing the second derivative for the sigmoid amplification reaction
Doronin M.I., PhD in Biological Science, Senior Researcher.
Michalishin D. V., PhD in Veterinary Science, Head of the Laboratory.
Starikov V. A., PhD in Veterinary Science, Leading Researcher.
Lozovoy D.A., Doctor of Science (Veterinary Medicine), Associate Professor, Deputy Director for Research and Development.
Borisov A., PhD in Veterinary Science, Leading Researcher.
Federal centre for animal health, federal governmental budgetary institution
This article presents an assessment of the main validation characteristics of the method of mediated concentration of 146S component offoot and mouth disease virus when comparing the graphs of the second derivative for real-time RT- PCR curves using a quadratic function C146S FMDV = 0,0111(СJ2-1,0157Cp+20,446. The range of application of real-time RT-PCR was 0.05-14.75 yg/cm3. When testing a virus-containing material with concentrations of 146S component from 0,05 to 5.00 yg/cm3, the validated method is characterized by high specificity (e is 0.2-5.0%), as well as high precision under convergence conditions and under reproducibility conditions. When assessing linearity and correctness, it was proved that the validated method gives error-free results with a high correlation coefficient (r = 0.9965, r - 1) and a degree of confidence (R2 = 0.993, R2 - 1). Validation results of real-time RT-PCR satisfy all eligibility criteria. Based on this, the proposed method is reliable and can be used for indirect quantitative assessment of the 146S immunogenic component of foot and mouth disease virus in unactivated raw materials for the vaccine.
Keywords: 146S immunogenic component of foot and mouth disease virus, vaccine, second derivative, real time RT-PCR, validation
Введение
При изготовлении вакцин в области ветеринарии промежуточное сырье и выпускаемая продукция проходит тщательный многоступенчатый контроль в соответствии с требованиями системы обеспечения качества.
В процессе производства вакцин против ящура одним их этапов технологического контроля сырья является определение концентрации 146S компонента вируса ящура, полученного в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ ARRIAH) [7]. 146S, или полные частицы обладают важнейшими биологическими свойствами вируса ящура и являются основными компонентами, определяющими иммуногенность вакцинных препаратов [8]. Традиционно для определения данного показателя вакцины применяли реакцию связывания комплемента в модификации А.Ф. Бондаренко. Одним из новых способов опосредованной оценки концентрации 146S компонента вируса ящура в неинактивированной суспензии для изготовления вакцины является сравнение максимальных экстремумов графиков второй производной (Ср) сигмоидных накопления флуоресцентного сигнала. Зависимость между количествами 146S частиц неинактивированного вируса ящура и максимальными экстремумами графиков второй производной кривой накопления флуоресцентного сигнала отражают в виде квадратичной функции C146S ВЯ = 0,0Ш(Сp)2-1,0157Cp+20,446 с достоверностью аппроксимации 99,3%. Данный способ является высокочувствительным и высокоспецифичным, позволяет анализировать большое количество образцов за 4-5 ч.
Оценку пригодности представленного способа проводят на основе результатов валидации, предполагающей определение специфичности, правильности, прецизионности, диапазона применения и линейности аналитической методики, а также предела обнаружения и количественного определения 146S компонента [5].
Специфичностью данной методики считается возможность однозначно опосредованно определять концентрацию 146S частиц вируса ящура в исследуемой суспензии при наличии в анализируемой пробе посторонних антигенных компонентов [4].
Для определения точности указанной методики раскрывают понятия правильности и прецизионности. Правильность - близость к эталонному среднему значению концентрации 146S компонента вируса ящура, полученного в результате большой серии экспериментов. Прецизионностью называют степень разброса значений максимальных экстремумов графиков второй производной кривых накопления сигнала флуоресценции между сериями измерений для множества проб, взятых из одного и того же образца в условиях, определенных методикой [2, 4]. Соответственно проводят анализ повторяемости результатов измерений в условиях сходимости и воспроизводимости, определяя абсолютные и относительные показатели вариации [9, 10, 11].
Предел обнаружения рассматриваемой методики - наименьшая концентрация 146S частиц вируса ящура, которые могут быть качественно детектированы [5]. Пределом количественного определения считается наименьшее значение концентрации 146S компонента вируса ящура, которое можно оценить количественно [3, 4, 5].
Для доказательства существования прямо пропорциональной зависимости значений Cp и концентрации 146S компонента вируса ящура в пределах аналитической области методики оценивают ее линейность [5]. Интервал между максимальным и минимальным значениями концентрации 146S частиц, в котором алгоритм определения аналитических частиц имеет приемлемый уровень прецизионности, правильности и линейности является диапазоном применения представленной методики [5, 9].
Цель исследования заключалась в оценке валидационных показателей методики опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура в вакцине при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной сигмоидных накопления флуоресцентного сигнала в ОТ- ПЦР-РВ.
Материалы и методы
Вирус ящура. Для исследования применяли культуральный вирус ящура штаммов А/Забайкальский/2013, А/Турция/2006, А/Краснодарский/2013, О/Приморский/2014, О/Саудовская Аравия/2008, О/Чечено-Ингушский/1966,Азия-1/Таджикистан/2011, Азия-1/Пакистан/2018, САТ-2/Саудовская Аравия/2000, репродукцию которых осуществляли в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH.
Определение концентрации 146S компонента в ОТ-ПЦР-РВ при анализе максимальных экстремумов графиков второй производной сигмоидных накопления флуоресцентного сигнала. Оценку концентрации 146S частиц методом ОТ-ПЦР-РВ проводили на основе сравнительного анализа максимальных экстремумов графиков второй производной сигмоидных накопления флуоресцентного сигнала в соответствии с требованиями, описанными ранее [6].
Реакция связывания комплемента (РСК). Для определения концентрации 146S частиц вируса ящура применяли количественный вариант РСК, проведение которого осуществляли в соответствии с требованиями [1].
Оценка специфичности методики. Специфичность методики определяли по относительной погрешности (e) результатов, полученных одновременно с использованием валидируемой методики ОТ-ПЦР-РВ и РСК [1]. Проводили исследование 9 модельных смесей культурального вируса ящура, которые содержали разное количество 146S частиц в смеси с 75S, 12S и 3,8S компонентами [7]. Фракционирование культурального вируса ящура на компоненты проводили с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы при 40 000 об./мин. [8]. Анализ осуществляли в 5 повторениях.
Концентрация 146S компонента вируса ящура по результатам ОТ-ПЦР-РВ, C146S - концентрация 146S компонента по данным РСК. Специфичность методики считали высокой при e < 5% [4, 5].
Оценка правильности методики. Для исследования правильности методики проводили анализ 350 проб культурального вируса ящура с известными значениями титра в ОТ-ПЦР-РВ. Данные были представлены в виде уравнения линейной зависимости между экспериментально найденными в ОТ-ПЦР-РВ (у) и истинными значениями концентрации 146S компонента (x): y=k-x+b. Для полученной функции проверяли гипотезы о тождестве тангенса угла наклона (k) единице и равенстве свободного члена (b) нулю. При доказательстве верности указанных гипотез со степенью надежности, равной 0,05, использование валидируемой методики дает свободные от ошибки результаты [2, 5].
Оценка прецизионности методики. Для исследования прецизионности методики ОТ ПЦР-РВ в условиях сходимости и воспроизводимости рассчитывали абсолютные и относительные показатели вариации [4, 5, 9].
Определение абсолютных показателей вариации. Размах вариации (R) оценивали как разность между наибольшим и наименьшим значениями
Cp:R = Cpmax-Cpmm.
Индивидуальное линейное отклонение (di) рассчитывали по формуле:
d = |Cp. - Срср|.
Среднее линейное отклонение (d) рассчитывали как среднее арифметическое из индивидуальных линейных отклонений по формуле: dld: N, где d - индивидуальные линейные отклонения пороговых циклов амплификации, N - объем совокупности. Оценку дисперсии (Ф2) показателей проводили с использованием формулы:
ф2 = (Јdi2) N.
Для характеристики размеров вариации Ct рассчитывали среднее квадратичное отклонение (5), пользуясь формулой:
ф = V(ф2) [3,11].
Определение относительных показателей вариации. Расчет коэффициента осцилляции (VR) проводили, пользуясь формулой:
VR = R:Ctср*100
Линейный коэффициент вариации (Cd) рассчитывали по формуле:
Сd = dср:Сtср*100
Для оценки колеблемости индивидуальных значений пороговых циклов амплификации определяли коэффициент вариации (C5) по формуле: C5 = 6:Ct,-100 [10, 11]. Метод считают надежным при C5<2% в условиях сходимости и C5<3% в условиях воспроизводимости [9].
Расчет нижнего предела обнаружения концентрации 146S компонента вируса ящура (ПОС1463). Наименьшую концентрацию 146S компонента вируса ящура с использованием валидируемой методики находили по формуле:
ПОС1463 = 3,3-Sb: k,
где Sb - стандартное отклонение аналитического сигнала, которое соответствует стандартному отклонению свободного члена (b); k - тангенс угла наклона [3, 4, 10]. Свободный член b находили при анализе 5 модельных образцов с концентрациями 146S частиц вируса ящура: 0,001; 0,01; 0,10; 0,50; 1,00 мкг/см3.
Вычисление предела количественного определения концентрации 146S компонента вируса ящура (ПКОі::1464). Минимальное значение концентрации 146S компонента вируса ящура, определенное с соответствующей правильностью и прецизионностью валидируемой методики, рассчитывали, применяя формулу [10, 11]: ПКОС1463 = 10-Sb:k. Полученное значение ПКОС1463 подтверждали экспериментально при исследовании 5 модельных суспензий вируса ящура с концентрациями 146S компонента, близкими к найденному значению предела количественного определения: 0,015; 0,030; 0,045; 0,050; 0,100 мкг/см3. Анализ проводили в 5 повторениях. Результаты исследования считали статистически достоверными при p<0,005.
Определение диапазона применения методики. Для исследования аналитической области валидируемой методики исследовали 8 модельных образцов со следующими значениями концентрации 146S частиц вируса ящура: 0,05; 0,50; 2,00; 5,00; 10,00; 14,00; 14,75; 15,00 мкг/см3 в 5 повторениях.
Определение линейности методики. Существование линейной зависимости порогового цикла амплификации и концентрации 146S компонента вируса ящура в пределах диапазона применения методики проверяли в экспериментально, определяя Ct для 50 проб с различными концентрациями 146S частиц в 5 повторениях. Полученные данные обрабатывали методом наименьших квадратов с использованием регрессии вида:
C=k-C146S+b,
где k - угловой коэффициент; b - свободный член. Достоверность результатов анализа подтверждали, вычисляя коэффициент корреляции (r), который по модулю должен быть > 0,99 [3, 4, 10].
Результаты и обсуждение
валидационный вирус ящур транскрипазный полимеразный
На первом этапе исследования определяли специфичности валидируемой методики для опосредованной оценки концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для вакцины при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ. Подготавливали 9 модельных образцов, добавляя к суспензиям 146S частиц, определяющих иммуногенность вакцины [7, 8], смесь 75S, 12S и 3,8S компонентов для выявления возможного их влияния на специфичность данной методики. Состав модельных образцов, а также результаты определения относительной погрешности (e) при исследовании в ОТ-ПЦР-РВ представлены в таблице 1.