Таблица 1
Оценка специфичности методики опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для вакцины при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ (n = 5, M±m)
|
№ смеси |
Состав модельной смеси |
Относительная погрешность (e) при измерении концентрации 146S частиц в сырье для вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ, % |
|||
|
название компонента |
содержание компонента в смеси, % |
концентрация 146S компонента, мкг/см3 |
|||
|
1 |
146S |
100 |
5,00 |
0,20-0,65 |
|
|
75S+12S+3,8S |
0 |
||||
|
2 |
146S |
80 |
4,00 |
0,25-1,50 |
|
|
75S+12S+3,8S |
20 |
||||
|
3 |
146S |
60 |
3,00 |
0,35-1,67 |
|
|
75S+12S+3,8S |
40 |
||||
|
4 |
146S |
40 |
2,00 |
0,50-2,00 |
|
|
75S+12S+3,8S |
60 |
||||
|
5 |
146S |
20 |
1,00 |
1,00-2,00 |
|
|
75S+12S+3,8S |
80 |
||||
|
6 |
146S |
10 |
0,50 |
2,00-3,12 |
|
|
75S+12S+3,8S |
90 |
||||
|
7 |
146S |
2 |
0,10 |
3,00-3,54 |
|
|
75S+12S+3,8S |
98 |
||||
|
8 |
146S |
1 |
0,05 |
4,00-5,00 |
|
|
75S+12S+3,8S |
99 |
||||
|
9 |
146S |
0,5 |
0,025 |
-* |
|
|
75S+12S+3,8S |
99,5 |
Примечание: * Cp превышают предельное значение, позволяющее применять функцию C,46S ВЯ = 0,0111(С )2-l,0157C +20,446.
Из данных таблицы 1 видно, что относительная погрешность опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура с помощью валидируемой методики при содержании 146S частиц 5,00-4,00; 4,00-3,00; 3,00-2,00; 2,00-1,00; 1,00-0,50; 0,50-,10; 0,10-0,05 мкг/см3 составляла 0,20-1,50; 0,25-1,67; 0,35-2,00; 0,50-2,00; 1,00-3,12; 2,00-3,54; 3,00 - 5,00%, соответственно. Таким образом, отмечали высокую специфичность методики для суспензий с концентрациями 146S частиц вируса ящура от 5,00 до 0,05 мкг/см3, при исследовании которых относительная погрешность не превышала 5%. В исследовании не анализировали пробы с концентрациями 146S компонента более 5,00 мкг/см3, поскольку в неинактивированных суспензиях культурального вируса ящура содержание не превышает данного значения.
Следующий этап исследования посвящен оценке правильности валидируемой методики, тестируя в ОТ-ПЦР-РВ 350 проб вируса ящура с концентрациями 146S компонента: 0,10; 0,50; 1,00; 2,00; 3,00; 4,00; 5,00 мкг/см3 (по 50 проб на каждую концентрацию). Результаты исследования представлены на рисунке 1 в виде линейной функции y = 0,9963-x+0,0149, которая при степени достоверности (R2) 0,9994, подтверждает, что тангенс угла наклона (k) стремится к единице (k = 0,9963), а свободный член (b) - к нулю (b = 0,0149). Таким образом, применение валидируемой методики позволяет получать достоверные результаты.
На следующем этапе проводили оценку прецизионности методики опосредованного определения концентрации 146S частиц вируса ящура в сырье для вакцины при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ с расчетом абсолютных и относительных показателей вариации.
Прецизионность в условиях сходимости определяли по вариабельности результатов реакции внутри одного исследования 5 суспензий культурального вируса ящура с концентрациями 146S компонента: 0,10; 1,00; 2,00; 3,00; 5,00 мкг/см3, которые одновременно тестировал один оператор на одном анализирующем термоциклере в 20 повторениях. Результаты статистического анализа полученной совокупности максимальных экстремумов сигмоидных ОТ-ПЦР-РВ (Cp. отражены в таблице 2, из данных которой следует, что размах вариации составил 0,040,29, среднее линейное отклонение - 0,0080,045, иными словами, уровень вариации Cpj в полученных выборках при указанных значениях концентрации 146S частиц вируса ящура относительно средней величины признака низкий. Коэффициент дисперсии находился в диапазоне 0,000-0,004, среднее квадратичное отклонение составило 0,0110,063, что подтверждает незначительную степень отклонений индивидуальных значений Cp от среднего арифметического (Срср). Таким образом, колеблемость индивидуальных значений в выборках низкая, а значения Cp представляют собой надежную совокупность.
Для оценки колеблемости полученных значений Cpj внутри генеральной совокупности определяли относительные показатели вариации. Коэффициент осцилляции составлял 0,208-0,981%, иными словами, относительное изменение крайних значений Cpj по сравнению со средней величиной во всех выборках низкое. Линейный коэффициент вариации находился в диапазоне 0,044-0,152%, следовательно, доля усредненного значения отклонений от Срср в каждой совокупности не значительна. Коэффициент вариации индивидуальных значений пороговых циклов амплификации составил 0,056-0,214%, что соответствует общим требованиям, предъявляемым к валидируемым методикам (Cg<2%) [3, 4, 5, 10].
Таким образом, при исследовании суспензий вируса ящура с концентрациями аналита от 0,10 до 4,00 мкг/см3 в 20 повторениях с помощью предложенной методики одним оператором получены однородные и надежные совокупности значений максимальных экстремумов графиков второй производной сигмоид ОТ-ПЦР-РВ, которые можно применять для опосредованного выражения концентрации 146S компонента вируса ящура.
Следующий этап работы был посвящен исследованию прецизионности валидируемой методики в условиях воспроизводимости. Для этого анализ суспензий культурального вируса ящура проводили два оператора в разное время в 20 повторениях (40 измерений для каждой пробы). Полученные результаты отражены в таблице 2, из которой следует, что для генеральной совокупности значений Cp размах вариации составил 0,07-0,66, среднее линейное отклонение (d) - 0,009-0,055, иными словами, степень колеблемости Cpt в полученных выборках относительно среднего уровня признака низкая. Дисперсия составила 0,000-0,008, среднее квадратичное отклонение - 0,012-0,091, что подтверждает незначительную степень отклонений индивидуальных значений Cp от среднего арифметического и высокий уровень достоверности результатов внутри каждой выборки максимальных экстремумов графика второй производной сигмоиды ОТ-ПЦР-РВ.
Рис. 1. Исследование правильности методики опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ (n = 5)
Исследуя относительные показатели вариации Cpp выявили, что коэффициент осцилляции составил 0,365-2,231%, линейный коэффициент вариации - 0,045-0,185%, коэффициент вариации - 0,064-0,185%, что соответствует общепринятым нормам (C5<3%) [3]. Исходя из полученных результатов, относительное изменение крайних значений Cp и доля усредненного значения абсолютных отклонений в сравнении со средним внутри каждой совокупности незначительна. Следует отметить, что вариация значений параметров валидации при исследовании суспензий вируса ящура с увеличением концентрации 146S компонента от 0,10 до 5,00 мкг/см3 снижалась, а степень достоверности результатов возрастала.
В результате сравнительного анализа данных, полученных при оценке прецизионности валидируемой методики, доказали, что в условиях сходимости степень достоверности результатов опосредованного определения концентрации 146S частиц вируса ящура выше по сравнению с оценкой, проводимой в условиях воспроизводимости, что соответствует общепринятым статистическим ожиданиям [9]. По абсолютным и относительным показателям вариации валидируемая методика удовлетворяла критериям приемлемости [3, 9, 11].
На следующем этапе исследования определяли предел обнаружения (POC146S) и количественного определения (ПКОС1463) концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для вакцины с помощью валиди- руемой методики. Проведя исследования в 7 повторениях, получили следующие значения свободного члена (b): 20,444; 20,446; 20,447; 20,448; 20,449; 20,443; 20,446. Учитывая, что стандартное отклонение свободного члена (Sb) составило 0,002, а тангенс угла наклона (k) был равен (-0,45), провели расчеты и определили, что nOc146S данной методикой составил 0,01551 мкг/см3 (или 15,51 нг/см3), а nKOC146S - 0,047 мкг/см3 (или 47 мкг/см3).
Таблица 2
Оценка прецизионности методики для опосредованного определения концентрации 146S частиц вируса ящура при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ (n = 5)
|
Валидационные показатели методики при оценке прецизионности |
Значения показателей валидации при исследовании суспензий с разными концентрациями 146S частиц вируса ящура (мкг/см3) |
||||||||||
|
условия сходимости |
условия воспроизводимости |
||||||||||
|
0,10 |
1,00 |
2,00 |
3,00 |
5,00 |
0,10 |
1,00 |
2,00 |
3,00 |
5,00 |
||
|
объем выборки Cp (N) |
20 |
20 |
20 |
20 |
20 |
40 |
40 |
40 |
40 |
40 |
|
|
среднее значение Cp (СРср) |
29,569 |
27,078 |
24,811 |
22,811 |
19,198 |
29,579 |
27,066 |
24,802 |
22,779 |
19,197 |
|
|
суммарное значение индивидуального линейного отклонения по модулю (X|di|) |
0,896 |
0,844 |
0,630 |
0,354 |
0,168 |
2,192 |
2,424 |
1,932 |
1,818 |
0,342 |
|
|
суммарное значение квадрата модуля индивидуального линейного отклонения (Xdi2) |
0,080 |
0,054 |
0,042 |
0,010 |
0,002 |
0,329 |
0,226 |
0,197 |
0,154 |
0,006 |
|
|
наибольшее значение Cp (Cp ) |
29,640 |
27,200 |
24,900 |
22,860 |
19,220 |
29,950 |
27,300 |
24,960 |
22,860 |
19,230 |
|
|
наименьшее значение Cp (Cpmin) |
29,350 |
27,000 |
24,690 |
22,770 |
19,180 |
29,290 |
26,980 |
24,650 |
22,600 |
19,160 |
|
|
размах вариации (R) |
0,290 |
0,200 |
0,210 |
0,090 |
0,040 |
0,660 |
0,320 |
0,310 |
0,260 |
0,070 |
|
|
среднее линейное отклонение (dm) |
0,045 |
0,042 |
0,031 |
0,018 |
0,008 |
0,055 |
0,061 |
0,048 |
0,045 |
0,009 |
|
|
дисперсия (52) |
0,004 |
0,003 |
0,002 |
0,001 |
0,000 |
0,008 |
0,006 |
0,005 |
0,004 |
0,000 |
|
|
среднее квадратичное отклонение (5) |
0,063 |
0,052 |
0,046 |
0,023 |
0,011 |
0,091 |
0,075 |
0,070 |
0,062 |
0,012 |
|
|
коэффициент осцилляции (VR), % |
0,981 |
0,739 |
0,846 |
0,395 |
0,208 |
2,231 |
1,182 |
1,250 |
1,141 |
0,365 |
|
|
линейный коэффициент вариации (Cd), % |
0,152 |
0,156 |
0,127 |
0,078 |
0,044 |
0,185 |
0,224 |
0,195 |
0,199 |
0,045 |
|
|
коэффициент вариации (C5), % |
0,214 |
0,191 |
0,185 |
0,099 |
0,056 |
0,306 |
0,278 |
0,283 |
0,272 |
0,064 |
Рассчитанное значение nKOC146S подтверждали экспериментально при исследовании 5 модельных образцов культурального вируса ящура с концентрациями 146S компонента: 0,015; 0,030; 0,045; 0,050; 0,100 мкг/см3 в пяти повторениях. Результаты анализа отражены в таблице 3.
Таблица 3
Выявление предела количественного опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ (n = 5, M±m)
|
№ суспензии вируса ящура |
Концентрация 146S частиц (C146S), мкг/см3 |
Исследование суспензии в ОТ-ПЦР-РВ |
Экспериментальное подтверждение, что теоретическое значение ПКО - 0,047 мкг/см3, 146S |
||
|
Cp |
концентрация 146S частиц (C146S), мкг/см3 |
||||
|
1 |
0,015 |
31,56 |
-* |
подтверждено |
|
|
2 |
0,030 |
30,49 |
- |
подтверждено |
|
|
3 |
0,045 |
30,14 |
- |
подтверждено |
|
|
4 |
0,050 |
29,52 |
0,048 |
подтверждено |
|
|
5 |
0,100 |
29,38 |
0,100 |
подтверждено |
Примечание: «-» - концентрация 146S частиц не определена, так как значение максимального экстремума графика второй производной сигмоиды ОТ-ПЦР-РВ выходит за пределы функции C146S ВЯ = 0,0111(Cp)2-1,0157Cp+20,446.
Из данных таблицы 3 следует, что экспериментальное значение nKOC146S валиди- руемой методикой подтверждает расчеты и составляет 0,050 мкг/см3.
При исследовании 8 модельных образцов с концентрациями 146S компонента вируса ящура: 0,05; 0,50; 2,00; 5,00; 10,00; 14,00; 14,75; 15,00 мкг/см3 определили, что аналитическая область опосредованной оценки содержания 146S частиц при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ находилась в диапазоне 0,05