В многочисленных клинических наблюдениях показано, что уровни NGAL в моче и плазме зависят от степени тяжести и длительности повреждения почек [25, 40, 50]. Даже единичное измерение уровня NGAL дает возможность отдифференцировать острое повреждение почек от их дегидратации или хронического заболевания [50].
Острая почечная недостаточность приводит к повышению концентрации NGAL и в крови, и во многих других тканях: в частности, в почках, легких, печени, в различных типах клеток иммунной системы - нейтрофилах, макрофагах и т. д. Свободно проникая в клубочки из плазмы, подобно большинству других белков, NGAL реабсорбируется обратно в проксимальных канальцах не за счет реабсорбции, а путем эндоцитоза. В отличие от многих антибактериальных белков типа лактоферрина, для которых доказана тесная связь с лейкоцитозом и степенью тяжести общего состояния больных, уровни NGAL очень слабо коррелируют с количеством нейтрофилов [4, 9]. Поэтому повышение уровня NGAL на фоне массивной секреции нейтрофилов - это явный признак бактериальной инфекции.
Доказана ценность NGAL в качестве раннего предиктора острой почечной недостаточности [4, 5, 9, 36]. В то же время на уровень сывороточного NGAL влияют различные сопутствующие заболевания - артериальная гипертония, хронические заболевания почек, красная волчанка и другие системные инфекции, воспалительные явления в дистальных или проксимальных отделах дыхательных путей, в кишечнике и онкологические заболевания [4, 9, 23]. Повышение уровня NGAL могут вызывать и некоторые лекарства, такие как цисплатин или рентгенконтрастные вещества. Все это снижает специфичность теста NGAL.
Наименьшие надежды с NGAL связывают онкологи, так как NGAL, связываясь с MMP-9, усиливает ангиогенез, инвазию опухоли и ее метастазирование, что является индикатором плохого прогноза [4, 36]. Таким образом, роль NGAL в организме человека многообразна, одной из наиболее важных биологических функций NGAL является предотвращение развития инфекции. Не менее важна роль NGAL как маркера при повреждении почек. Однако, наряду с многочисленными достоинствами эффектов NGAL для организма, у этой молекулы выявлены и неблагоприятные для организма качества.
Лактоферрин
Лактоферрин (ЛФ) - это биологически активная молекула, относящаяся к железосодержащим белкам из семейства трансферринов. M. Sоrensen, S.P. L. Sоrensen в 1939 г. впервые обнаружили ЛФ в молоке человека и коровы и назвали его «красный белок молока». Этот белок является продуктом секреции эпителиоцитов различных типов желез внутренней секреции, которые выделяют ЛФ как в слизистые оболочки молочных желез, так и во многие другие типы биологических жидкостей организма. Значительно позднее установлен факт синтеза ЛФ вторичными гранулами нейтрофилов и макрофагов, что имеет первостепенное значение для антибактериальной защиты [13, 34]. Оба варианта ЛФ синтезируются одним и тем же геном [34, 39].
С биохимической точки зрения ЛФ имеет самый положительный заряд из всех представителей семейства трансферринов. Его изоэлектрическая точка имеет значение рН 8,4-9,0, в то время как pH остальных представителей трансферринов колеблется в диапазоне от 5,4 до 5,9. Высокая основность ЛФ объясняет не только его способность связывать ионы железа, но и его активность по отношению к другим анионным макромолекулам и различным типам клеток.
ЛФ представляет собой гликозилированный одноцепочечный белок весом 80 кДа из 708 аминокислот. Единственная полипептидная цепь ЛФ складывается в две симметричные глобулярные доли, представляющие N- и C-концевые половины полипептида. Обе доли дополнительно подразделяются на два домена, N1 и N2, C1 и C2. ЛФ имеет по одному сайту обратимого связывания трехвалентного железа в каждой доле. Четыре белковых лиганда через карбонат-анион связывают оба иона металла и два домена в единую высокостабильную структуру ЛФ.
Третичная структура ЛФ человека, свиньи, лошади, коровы, овцы, козы, верблюда, кролика и мыши построена аналогичным образом и имеет сходные сайты связывания железа. Все ЛФ гликозилированы, однако местоположение участков гликозилирования отличается для белков различных видов животных. При этом присоединение углеводов к белкам снижает их восприимчивость к протеолизу и термической денатурации.
Из-за обратного связывания железа ЛФ может существовать в двух формах: без железа - в апоформе, или в ассоциации с железом - в голоформе, имеющих различные трехмерные конформации. Связанная с железом форма ЛФ является конформационно жесткой и очень стабильной. Конформационные изменения голо- и апо-форм ЛФ не отражаются на поверхности макромолекулы и, следовательно, не влияют на способность ЛФ связывать бактериальные и вирусные рецепторы [13, 34].
В 1992 г. W. Bellamy с соавторами [33] идентифицировали в составе N-концевого участка полипептидной цепи ЛФ бактерицидного домена, который назвали лактоферрицин. Этот бактерицидный домен за счет специфического распределения положительно заряженных участков по поверхности макромолекулы образует сайт связывания для бактериального липополисахарида (LPS).
Еще более выраженный бактерицидный и фунгицидный эффект обнаружен у лактоферрицина [33], который выделен из ЛФ путем его гидролиза пепсином. В этом же антимикробном домене лактоферрина в 2004 г. был открыт еще один бактерицидный пептид [33], названный лактоферрампин, который также способен инициировать свою бактерицидную активность, нарушая целостность мембраны.
Такие пептиды, как лактоферрицин и лактоферрампин, ответственны за основные антимикробные активности, получаемые путем ферментативного гидролиза лактоферрина, в 9 раз эффективнее в уничтожении бактерий, чем интактный белок. Пептиды проявляли активность против всех протестированных бактерий (E. coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Listeria spp., Staphylococcus spp.) и эффективны против инфекций, вызываемых устойчивыми к антибиотикам Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae. Установлено, что для реализации антимикробной активности лактоферрицина и лактоферрампина наибольшее значение имело сохранение в их структуре двух первых остатков аргинина.
Железо является необходимым нутриентом для роста почти всех бактерий. Бактериостатическая форма ЛФ представляет собой либо апо-форму ЛФ, либо частично насыщенный ЛФ, поскольку полностью насыщенная форма не обладает антимикробной активностью. В этом случае бактерицидный эффект ЛФ можно восстановить путем добавления цитрата железа или натрия.
В процессе эволюции бактерии для удержания необходимого для их жизнедеятельности железа выработали несколько приспособительных механизмов. Один из них - синтез бактериями рецепторов, распознающих сидерофоры. Константа связывания для ионов железа у сидерофоров настолько высока, что позволяет отбирать эти ионы от трансферрина и лактоферрина. Кроме того, бактерии имеют и мембранные белки, которые функционируют в качестве рецепторов для комплексов трехвалентного железа с сидерофорами. Например, E. coli продуцирует хелатные соединения железа, такие как энтеробактин и аэробактин, экспрессирующиеся на наружных мембранах бактериальных клеток в форме рецепторов цитрата железа. Многие бактерии имеют специфические рецепторы на наружных мембранах, которые непосредственно связывают железо, отобранное у лактоферрина и трансферрина.
Несколько групп исследователей показало, что ЛФ убивает чувствительные микроорганизмы с помощью других механизмов, отличных от метаболизма железа, путем прямого взаимодействия с поверхностью бактериальных клеток. Этот бактерицидный механизм, ограничивающий размножение и адгезию микробов, основан на взаимодействии молекулы ЛФ с отрицательно заряженными компонентами клеточной поверхности бактерий. ЛФ вызывает высвобождение липополисахарида из клеточной стенки грамотрицательных бактерий, что приводит к увеличению проницаемости внешней мембраны. ЛФ с высокой степенью аффинности связывается с липидом A липополисахарида и может ингибировать рост бактерий или убивать их. В дополнение к этому антимикробному эффекту ЛФ, как сообщается, снижает липополисахарид-индуцированное высвобождение цитокинов.
ЛФ в одиночку проявляет в основном бактериостатический эффект, но в сочетании с другими противомикробными белками, такими как лизоцим, обладает синергетическим эффектом и бактерицидным действием на грамотрицательные бактерии. Кишечная палочка и многие другие грамотрицательные бактерии имеют на своей поверхности рецепторы порообразующих белков (поринов), которые создают бактериальный барьер для антибиотиков в наружной мембране бактерий. ЛФ распознает эти порины и связывается с ними.
Предполагается, что хронические инфекции связаны с образованием биопленки [50]. ЛФ путем хелатирования железа стимулирует сморщивание подвижной поверхности биопленки и ингибирование образования кластеров.
Лактоферрин это полифункциональный белок, которому, кроме регуляции гомеостаза железа и антибактериальных свойств, приписывается еще несколько биологических функций, в том числе клеточный рост и дифференцировка, противовоспалительная активность и защита от развития рака и метастазирования [13, 34].
Биологическая активность ЛФ зависит от присутствия конкретных клеток-мишеней и наличия на их поверхностях специфических рецепторов, таких как рецептор к ЛФ человека, обеспечивающий поглощение железа в тонком кишечнике новорожденных или рецептор к ЛФ на моноцитах, участвующий в воспалительных реакциях. Рецепторы к ЛФ также обнаружены в гепатоцитах, лимфоцитах, тромбоцитах, фибробластах и клетках остеобластов.
Установлено, что ЛФ способен модулировать воспалительный процесс и общий иммунный ответ. Известно, что люди с врожденным или приобретенным дефицитом ЛФ имеют повторяющиеся инфекции. Защитный эффект ЛФ включает в себя ингибирование продукции нескольких провоспали- тельных цитокинов: включая интерлейкины IL-1Я и IL-6, а также фактор некроза опухоли a (TNF-a), [13, 34].
ЛФ модулирует иммунный ответ путем уменьшения образования свободных радикалов.
А.В. Коханов с соавторами (2010) предлагают использовать ЛФ при аллергических воспалительных заболеваниях человека, уменьшая накопление эозинофилов в дыхательных путях и предотвращая развитие клеток, продуцирующих муцин [11]. На клеточном уровне ЛФ модулирует миграцию и активацию клеток [13, 34]. Согласно современным представлениям, ЛФ может действовать как мощный противовоспалительный белок в очагах воспаления, включая дыхательные пути и желудочнокишечный тракт [33, 34].
ЛФ - это полифункциональный белок, который иногда причисляют к белкам острой фазы воспаления. При развитии острой воспалительной реакции ЛФ высвобождается из нейтрофилов и макрофагов и взаимодействует с Toll-рецепторами CD 284, CD 14 и CD 22, модулируя провоспалительную активность цитокинов TNF-a, IL-1, IL-6, а также усиливая пролиферацию Т-лимфоцитов (CD4+, CD8+) и NK-клеток [13].
В норме ЛФ в крови и сыворотке колеблется в пределах 400-1000 нг/мл и очень высоко поднимается у пациентов с гнойно-септическими процессами [18, 26], сепсисом [13, 26], пневмониями [13], панкреатитом [8, 26], при онкологических заболеваниях [10, 13]. Активно исследуется ЛФ как индикатор воспалительных процессов в почках и кишечнике [18, 33].
Белок Тамма-Хорсфалла
В почках обнаружен специфический гликопротеин, местом синтеза которого являются исключительно эпителиальные клетки толстой части восходящего отдела в петле Генле [43, 58, 62]. Впервые этот белок был обнаружен в 1952 г. Игорем Таммом и Франком Хорсфаллом в моче здоровых людей, позднее он был выявлен у многих млекопитающих, однако название белка Тамма-Хорсфалла (БТХ) закрепилось за ним. В современной литературе БТХ часто называют уромодулином [24, 62]. В мономерной форме белок имеет массу около 80-85 килодальтон, из которых 30 % приходится на углеводный компонент, представленный N-гликанами и сиаловыми кислотами [57, 58]. Клинически значимым свойством БТХ является склонность к полимеризации белка с образованием полианионной гелеобразной структуры, с молекулярной массой в несколько миллионов дальтон, которая обеспечивает водонепроницаемость эпителиального слоя [43, 65]. Оторвавшись от мембраны почечных канальцевых клеток, БТХ выделяется с током мочи. В моче здоровых людей БТХ составляет важную часть белковой фракции мочи, при этом с мочой ежедневно выделяется примерно 50 мг этого белка [58]. БТХ в моче выполняет несколько важных функций: при его участии регулируется коллоидноосмотическое давление, создаются условия для формирования пересыщенных растворов солей и их кристаллизации и, как следствие, создаются условия для формирования гиалиновых мочевых цилиндров [32, 35, 46, 56, 58]. Таким образом, БТХ играет важную роль в предотвращении восходящей инфекции мочевыводящих путей.
Подобно другим рассматриваемым в данном обзоре антибактериальным белкам, БТХ оказывает влияние на различные компоненты иммунной системы (TNF-a, IL- 1Я, IL-8, компоненты системы комплемента C1, C1q и C3, IgG и легкие цепи иммуноглобулинов). Следовательно, диагностическое значение БТХ в патогенезе нефропатий может проявляться как в виде нарушений структуры или функций почек, так и в виде характеристик, отражающих воспалительные изменения в различных отделах урогенитального тракта [24, 37, 56, 58]. Для количественного определения БТХ в моче сегодня разработан высокочувствительный и специфичный метод иммуноферментного анализа [12, 44, 45].