Уропротеины с антибактериальными свойствами: клинико-диагностическое значение
Серебряков Александр Александрович, аспирант кафедры химии; Коханов Александр Владимирович, доктор медицинских наук, профессор кафедры биологической химии; Николаев Александр Аркадьевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой химии, ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России
Описаны физико-химические и биологические свойства лизоцима, лактоферрина, липокалина, белка Тамма-Хорсфалла и других пептидов мочи с антимикробной активностью. Показано, что белки и пептиды не только проявляют антибактериальные, антифунгицидные и даже противовирусные свойства, но и непосредственно воздействуют на различные звенья иммунной системы. На биохимическом и клеточном уровнях у этих протеинов и пептидов реализуется множество специфических механизмов влияния на конкретных возбудителей, как по принципу модуляции специфических факторов иммунитета, так и по механизму воздействия на неспецифическую резистентность. Установленные факты создают перспективу для использования препаратов на основе антибактериальных уропротеинов в качестве диагностических инструментов и лекарственных средств для лечения инфекций мочевых путей.
Ключевые слова: уропротеины, лизоцим, лактоферрин, липокалин-2, белок Тамма-Хорсфалла, физико-химические свойства, биологическая роль, диагностическое значение, применение.
Uroproteins with antibacterial proprieties: value for clinic and diagnostic
Serebryakov Aleksandr A., post graduate student; Kokhanov Aleksandr V., Dr. Sci. (Med.), Professor of Department; Nikolaev Aleksandr A., Dr. Sci. (Med.), Professor, Head of Department, Astrakhan State Medical University
The review article describes the physicochemical and biological properties of lysozyme, lactoferrin, lipocalin, Tamm-Horsfall protein, and other urine peptides with antimicrobial activity. It was shown that proteins and peptides not only exhibit antibacterial, antifungicidal and even antiviral properties, but also directly affect various parts of the immune system. At the biochemical and cellular levels, these proteins and peptides have many specific mechanisms of influence on specific pathogens, both by the principle of modulation of specific immunity factors and by the mechanism of action on nonspecific resistance. The established facts create the prospect of using drugs based on antibacterial uro- proteins as diagnostic tools and drugs for the treatment of urinary tract infections.
Key words: uroproteins, lysozyme, lactoferrin, lipocalin-2, Tamm-Horsfall protein, physicochemical properties, biological role, diagnostic value, application.
Введение
В нормальной моче человека содержится минимальное количество белка, не выявляемое рутинными лабораторными анализами на его наличие. При ряде заболеваний, прежде всего при почечной патологии, содержание белка в моче возрастает, что проявляется протеинурией различного генеза. Кроме сывороточных белков, источником белка в моче могут быть органоспецифические белки различных отделов мочевыделительной системы [3, 5, 15, 21]. На фоне протеинурии в моче повышается активность диагностически значимых ферментов практически всех видов обмена: углеводного, липидного, белкового и энергетического [5, 20]. Современные протеомные и иммуно-химические технологии позволили накопить информацию о достаточно большом количестве белков и пептидов, выявляемых в моче как здоровых людей, так и больных с ренальной и экстраренальной патологией [8, 10, 21]. В настоящее время интенсивно исследуется функция уропротеинов и уропептидов, обнаруженных в моче [7, 11, 22, 68]. В ряде исследований постулируется роль некоторых уро- пептидов как естественных антиинфекционных факторов мочевой системы [7, 11, 60].
Антибактериальную активность проявляют следующие уропротеины относящихся к различным по строению классам биополимеров: уромоделин, ранее известный как белок Тамма-Хорсфалла, лактоферрин, лизоцим, липокалин, секреторный ингибитор протеиназы лейкоцитов, дефензин, кателицидин, гепсидин, миелопероксидаза и рибонуклеаза [6, 25, 51, 60]. И этот список непрерывно расширяется [61]. Как правило, уропротеины с антимикробной активностью относятся к небольшим катионным белкам, часто термостабильным [2, 6, 27], за счет электростатического взаимодействия нарушающим целостность отрицательно заряженной клеточной стенки бактерий [29, 67]. Источником антимикробных уропротеинов служат лейкоциты или эпителиальные клетки мочевыделительной системы [68].
Цель: проанализировать и обобщить сведения, касающиеся антимикробных свойств белков и пептидов мочи, представляющих интерес для медицинской общественности как наиболее перспективных для применения в качестве диагностических инструментов и лекарственных препаратов.
лизоцим белок антимикробный моча
Лизоцим
Лизоцим, открытый в 1922 г. Александром Флемингом, в хронологическом плане стал первым белком с досконально изученной антибактериальной активностью. По химическому строению лизоцим - это небольшой белок с массой от 10 до 18 тысяч дальтон, относящийся к классу гидролаз (КФ 3.2.1.17), способный гидролизовать Я-1,4 гликозидную связь между молекулами N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина. В результате такого действия фермента мурамидазы нарушается структура пептидогликана в бактериальной клеточной стенке и происходит лизис бактерий.
По химическому строению молекула лизоцима представлена единственной полипептидной цепью из 127-130 остатков аминокислот, всегда начинающейся лизином на N-конце и заканчивающейся лейцином на C-конце цепи. Лизоцим содержит большое количество аминокислот аргинина и лизина, придающих ему основный характер. Изоэлектрическая точка лизоцима находится в щелочном диапазоне между 10,5-11,0. Третичная структура белка стабилизирована четырьмя дисульфидными связями, причем у лизоцима нет свободных SH-групп.
Лизоцим относится к термостабильным белкам, в обычных условиях он стабилен при температуре 70°С, а в слабокислой среде его раствор выдерживает даже кипячение в течение 45 минут. Растворимость, термостабильность и ферментативная активность лизоцима резко снижается в щелочной среде.
Лизоцим - универсальный фермент, широко распространенный в природе среди представителей всех царств: животных, грибов и растений, бактерий и даже вирусов [8, 17]. Сегодня семейство лизоцимов, кроме давно известных лизоцимов животных, включает в себя лизоцимы бактериофагов, бактериальные мурамидазы, гликозидазы и хитозаназы, а также лизоцимоподобные белки, общим свойством которых, кроме способности к гидролизу гликозидных связей в пептидогликанах бактерий, является сходная вторичная и третичная структура лизоцимов, а также единый план строения их активных центров. Например, лизоцимы типа гликозидаз (КФ 3.2.1.14) и хитозаназ (КФ 3.2.1.132), помимо мурамидазной субстратной специфичности, обладают способностью гидролизовать связи между двумя соседними остатками N-ацетилглюкозамина в молекулах хитина или хитозана.
Лизоцим не разрушается протеолитическими ферментами, например, трипсином и папаином, наоборот, ионы металлов (типа, Mn2+) повышают устойчивость лизоцима к действию протеиназ. Ферментативная активность лизоцима в момент формирования фермент-субстратного комплекса во многом зависит от наличия остатка аминокислоты триптофана, а на стадии гидролиза гликозидной связи требуется четкое кооперативное взаимодействие остатка глутаминовой кислоты в 35 положении полипептидной цепи, с остатком аспарагиновой кислоты, находящемся в 52 положении.
Лизоцим обладает многообразными функциями. Например, роль лизоцима у бактериофагов сводится сначала к проникновению нуклеиновых кислот фага внутрь бактерии, а после завершения литического цикла заключается в выходе зрелых частиц вируса. Мурамидазы в период роста и деления бактерий принимают участие в обменных процессах в стенках бактерий, постоянно участвуют в транспорте многих макромолекул, а также обеспечивают межвидовую конкуренцию бактерий. Основная роль лизоцима у позвоночных и человека состоит в защите организма-хозяина от большого числа патогенов бактериальной и, возможно, грибковой природы.
Лизоцим в организме человека обнаруживается в составе различных тканей и биологических жидкостей, например, в клетках крови основным депо лизоцима являются моноциты крови, тканевые макрофаги и полиморфноядерные лейкоциты. Некоторые неспецифические факторы защиты, такие как лактоферрин, секреторный IgA [8] и многие пероксидазные системы, проявляют синергизм в отношении бактерицидного эффекта лизоцима.
Среди других механизмов бактерицидного действия лизоцима можно отметить активацию фагоцитоза в макрофагах и лейкоцитах. Как литический фермент лизоцим не только растворяет клеточную оболочку бактерий и грибов, но и угнетает размножение вирусов [8, 17]. Лизоцим непосредственно способен стимулировать выработку антибактериальных антител и активировать иммунитет. Среди прочих замечательных свойств лизоцима следует отметить его противовоспалительный, муколитический и ранозаживляющий эффекты.
Однако основным назначением лизоцима остается лечение гнойно-бактериальных заболеваний, прежде всего, в качестве лекарственного средства, усиливающего действие антибиотиков, особенно пенициллинового ряда [17, 19]. Лизоцим в значительной степени угнетает рост грамположительной микрофлоры, грамотрицательные бактерии к нему менее чувствительны.
Лизоцим показан в комплексной антимикробной терапии при хронических септических состояниях и гнойных процессах, для лечения ожогов, отморожений, конъюнктивитов, эрозий роговицы, афтозных стоматитов и других инфекционных заболеваний.
Тест на лизоцим в моче и сыворотке крови имеет диагностическое значение в качестве маркера острого моноцитарного лейкоза и острого миеломоноцитарного лейкоза. Повышенные уровни лизоцима в синовиальной жидкости характерны для артритов и остеоартрозов. Лизоцим в слюне является маркером инфекции ротовой полости и связанной с ней гипергликемии, гипертензии и ранних стадий сердечно-сосудистой патологии. В новейших исследованиях гена лизоцима установлено, что некоторые его мутации у человека могут приводить к наследственному системному амилоидозу.
Для медицинского применения допускается только очищенный лизоцим человека, а для наружного применения, глазных капель и косметической продукции вполне подходит лизоцим, полученный из белка куриных яиц, дополнительно очищенный до гомогенного состояния.
Как пищевая добавка Е1105 препараты лизоцима широко используются для изготовления сыров и иной кисломолочной продукции, а как консервант Е1105 применяется при производстве некоторых видов лекарств [17].
Липокалин
В 1993 г. во вторичных гранулах полиморфно-ядерных клеток человека был однаружен новый низкомолекулярный компонент, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов, получивший название сидерокалин или липокалин 2. Историческое название NGAL (neutrophil gelatinase associated lipocalin) не совсем точно, так как не отражает возможности синтеза липокалина разными типами клеток в различных органах. Поэтому NGAL в литературе упоминается под названиями: липокалин нейтрофилов, ЛН (neutrophil lipocalin, NL), липокалин из нейтрофилов человека, ЛНЧ (human neutrophil lipocalin, HNL), липокалин 2 (lipocalin 2), сидерокалин (siderocalin), утерокалин (uterocalin), он же онкогенный белок 24p33 (oncogene protein 24p33), 2-micro-globulin-related protein [4, 49].
NGAL синтезируется в клетке в форме полипептида с молекулярной массой 22 килодальтона, который в процессе посттрансляционного гликозилирования набирает массу 25 килодальтон. Как и другие липокалины, NGAL имеет общую для белков третичную структуру, представляющую собой восемь бочкообразных антипараллельных Я-листов с участком связывания гидрофобного лиганда в их углублении.
Именно в этом «кармане» происходит связывание липокалинов с сидерофорами, образуется макромолекулярный комплекс. Бактериальные белки-сидерофоры (энтерохелин и аэробактин) обеспечивают возбудителей ионами железа, однако в присутствии NGAL транспорт и доставка железа в клетки бактерий с помощью бактериальных сидерофоров нарушается.
Таким образом, одной из наиболее важных биологических функций NGAL является предотвращение развития инфекции путем подавления роста бактерий, что на клеточном уровне реализуется путем лишения клеток бактерий железа [36, 40]. В зависимости от присутствия (голо-NGAL) или отсутствия (апо-NGAL) сидерофора активность NGAL может изменяться в диаметрально противоположном направлении.
Сидерофоры являются одним из важнейших, но не единственным лигандом NGAL, в частности, NGAL может связывать другие специфические рецепторы на клеточной поверхности, что позв о- ляет некоторым авторам причислить NGAL к группе транспортных белков.
Как уже упоминалось, NGAL может связываться с желатиназой определенного типа, а именно - с матриксной металлопротеиназой 9-го типа (ММП-9). ММП - это ферменты, относящиеся к семейству цинковых металлопротеиназ, регулирующих обмен белков в межклеточном матриксе. Все эти белки имеют сходную первичную структуру, субстратную специфичность и клеточную локализацию, синтезируются в форме проферментов. Наиболее важные представители ММП относятся к семействам коллагеназ и желатиназ, а к подсемействам коллагеназ IV типа - наиболее важные представители - желатиназа А (ММП-2) и желатиназа В (ММП-9). Таким образом, желатин - это деструктурированный коллаген.
NGAL в комплексе с нейтрофильной коллагеназой IV типа (ММП-9) регулирует состав межклеточного матрикса, гидролизуя коллаген IV типа, тем самым обеспечивая инвазию кератиноцитов, моноцитов, тканевых макрофагов, полиморфно-ядерных лейкоцитов и различных типов злокачественных клеток через базальные мембраны.
За 3 года до открытия NGAL в составе активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов, до появления самого термина (липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов) J. Mishra с соавторами в 1989 г., в условиях детского кардиохирургического отделения, после операции на сердце, сопровождавшейся ишемией и реперфузионными осложнениями на фоне острой почечной недостаточности, обнаружили в крови ребенка чрезвычайно быстрое повышение концентрации неизвестного вещества [49].
После отождествления биосинтеза NGAL с патологией почек была установлена точная локализация его повышенного синтеза в области проксимальных канальцев. Поражение почек нефротоксическими соединениями или хроническая почечная недостаточность также могут стать причинами увеличения NGAL в моче и сыворотке крови [9, 23, 40].
Очень быстрое повышение концентрации крови (от 2 до 6 часов) позволило проводить раннее лечение пациентов после почечного приступа, в отличие от других маркеров, таких как креатинин сыворотки, уровень которого повышается только через 48-72 ч после приступа почек. Таким образом, повреждение почечных канальцев у человека и лабораторных животных сопровождается резким возрастанием уровня NGAL в моче, плазме и сыворотке крови, а также в паренхиме почек [4, 9]. Причем если уровень NGAL в сыворотке крови возрастает в 7-16 раз, то в моче он увеличивается даже в 25-1 000 раз [4, 36, 40].