Статья: Содержание фитогормонов, рост и развитие растений гречихи под действием импульсного давления

Статья по теме:

Содержание фитогормонов, рост и развитие растений гречихи под действием импульсного давления

Е.Э. Нефедьева, Н.Г. Мазей, А.А. Мирошниченко, В.Н. Хрянин

Исследовали закономерности изменения морфологических признаков и гормонального баланса проростков гречихи разного возраста в зависимости от величины импульсного давления, возникающего в ударной волне. Оценивали семенную продуктивность растений гречихи, подвергнутых стрессу. Анализировали эмпирическое и нормальное распределение по частотам варьирования семенной продуктивности растений гречихи после воздействия импульсного давления.

Реакция растений на воздействие различных физических или химических факторов может быть неадаптивной или адаптивной в зависимости от запрограммированной устойчивости (1, 2). Стрессоры в малых дозах могут быть использованы в качестве стимуляторов физиологических процессов растений. Нами предложен способ обработки семян импульсным давлением, характеризующийся эффективностью и высокой воспроизводимостью результатов (3). Предполагается, что рецепторы, воспринимающие механическое сжатие и давление, связаны с мембранами клеток. После рецепции сигнала в клетках происходят как неспецифические стрессовые реакции, так и специфические изменения. Поэтому представляло интерес выяснить, какие физиологические изменения способствуют повышению урожайности.

Ранее нами было показано, что импульсное давление (ИД) в диапазоне 11-29 МПа стимулирует ростовые и продукционные процессы у растений гречихи (4). В частности, отмечено возрастание митотического индекса в 2,6-2,8 раза в корневых меристемах проростков в возрасте 48-58 ч, а также изменение гормонального баланса проростков, влияющее на формирование вегетативных и генеративных органов, что способствовало увеличению продуктивности растений.

Известно, что этапы онтогенеза растений находятся под контролем фитогормонов (5). Гормоны усиливают адаптивные возможности и приспособительные реакции растительных организмов к стрессовым факторам. В частности, абсцизовая кислота (АБК), получившая название «гормон стресса», играет ключевую роль в индукции синтеза более десятка стрессовых белков; протекторная роль большинства из них доказана (5, 6). Показано, что при выращивании растений ячменя в условиях клиностатирования в течение 7 сут наблюдается 23-кратное увеличение содержания АБК по сравнению с контролем, а также повышение в 10-16 раз концентрации этилена (7). К числу важных ответных реакций на воздействие разнообразных стрессовых факторов среды относятся сдвиги гормонального баланса растений, обусловленные не только накоплением АБК, но и снижением содержания индолилуксусной кислоты (ИУК) и цитокининов, что, по-видимому, связано с переключением функциональной активности клеток под влиянием стрессоров.

Целью настоящей работы было выявление закономерностей изменения морфологических признаков и гормонального баланса проростков гречихи в зависимости от ударно-волнового воздействия и оценка семенной продуктивности растений.

Методика. Исследования проводили на растениях гречихи Fagоpyrum esculentum Moench. сорта Аромат в мелкоделяночном опыте; семена сеяли 15-17 мая, урожай собирали 25-27 августа. Сухие семена перед посевом (15000 шт.) помещали в поролоновые кассеты (по 500 г в каждую), укладывали на дно контейнера из нержавеющей стали, заполненного водой, и обрабатывали импульсным давлением (ИД) с амплитудой 11-29 МПа по ранее разработанной методике (3).

Давление на фронте волны (Р) рассчитывали по формуле: P = = 5330(1/3Q:R)1,13 (МПа), где Q -- масса заряда взрывчатого вещества, кг; R -- расстояние от центра взрыва до поверхности семян, м. ИД создавали прохождением ударной волны, возникающей при детонации водостойкого взрывчатого вещества и распространяющейся в воде. Семена при этом испытывали кратковременное объемное сжатие в течение 15-25 мкс.

Содержание фитогормонов (ИУК, зеатина, гиббереллина А3 и АБК) определяли на следующих фазах: прорастания семян на 2-е сут после замачивания (биотест); недифференцированного конуса нарастания на 8-е сут (метод ВЭЖХ); формирования листьев и пазушных вегетативных побегов на 11-е сут (биотест) (8-12). Материал фиксировали в жидком азоте и проводили три параллельных определения. В состав исходного образца входило 20-40 выборочных проб. Фитогормоны экстрагировали из гомогенизированного материала 5-кратным объемом 80 % этанола (трижды по 24 ч). Спиртовой экстракт отделяли фильтрованием и концентрировали до водного остатка при температуре не выше 40-50 оС. Водный остаток промораживали в течение 1 сут при температуре -25…-50 оС, закисляли 1 н. НСl до рН 2,8-3,0; ИУК, АБК, гиббереллины трижды экстрагировали равным объемом этилацетата. Суммарный этилацетатный экстракт упаривали до сухого остатка и растворяли в этаноле. Оставшийся после этилацетатной экстракции кислый водный раствор подщелачивали 1 н. NaOH до рН 8-9 и трижды экстрагировали цитокинины равным объемом водонасыщенного бутанола. Объединенный экстракт упаривали до сухого остатка и растворяли в этаноле.

Тонкослойную хроматографию ИУК, АБК и гиббереллина А3 (ГА3) проводили на пластинках Silufol-254 в смеси изопропанол, 28 % NН3 и Н2О (10:1:1); цитокининов -- в смеси бутанол, ацетат и Н2О (4:1:1). В качестве стандартов использовали спиртовые растворы ИУК, АБК, ГА3 («Sigma», США), зеатина («Calbiochem», США). После того как с хроматограммы элюировали ИУК, АБК, цитокинины, из оставшегося на пластинке силикагеля элюировали суммарное количество ГА3. В предварительной работе после опрыскивания хроматограммы 5 % H2SО4 и прогревания были выявлены пятна, флюоресцирующие в УФ-лучах, по которым идентифицировали положение ГА3 на хроматограмме. Элюирование проводили 80 % этанолом 2 ч при 25 оС. В полученных спиртовых растворах определяли содержание фитогормонов методом ВЭЖХ на приборе Милихром-4 с колонкой 2100 мм, заполненной сорбентом Нуклеосил С16 (диаметр частиц 5 мкм), используя вышеперечисленные стандарты.

Фитогормоны хроматографировали при соблюдении следующих условий: ИУК -- 96 % этанол (растворитель), 20 % ацетонитрил (элюент, расход 120 мкл/мин), = 220 нм; ГА3 -- 20 % этанол (растворитель и элюент) в 2 сМ трис-ацетате, pH 8,0 (расход 100 мкл/мин), = 204 нм; зеатин -- 20 % метанол (растворитель), 20 % ацетонитрил (элюент, расход 110 мкл/мин), = 270 нм; АБК -- 40 % водный метанол (растворитель), 30 % водный метанол (элюент, расход 110 мкл/мин), = 234 нм. Содержание фитогормонов определяли по соотношению площадей пиков проб и стандартов.

Для биотеста на ИУК семена пшеницы сорта Альбидум 48 замачивали в течение 24 ч при температуре 24 оС, а затем проращивали 2 сут в термостате при 25 оС. Из колеоптилей длиной 18-20 мм вырезали участки длиной 0,5 см (10 шт.), которые помещали в пузырьки из-под пенициллина вместе с зоной хроматограммы, заливали 2 мл 2 % раствора сахарозы и инкубировали 18-20 ч в темноте при 26 оС.

Биотест на ГА3 проводили на семенах салата сорта «Берлинский», которые проращивали 20 ч на свету при комнатной температуре и 48 ч в темноте при 26 оС до длины гипокотилей 4-5 мм. В чашки Петри заливали 0,75 % агар, после застывания делали 10 надрезов, в которые высаживали проростки салата, причем на семядоли наносили по 5 мкл экстрактов фитогормона. Чашки Петри накрывали стеклом и оставляли на 1 сут на свету при 26-28 оС, после чего измеряли длину гипокотилей.

Основой биотеста на активность цитокининов служила способность последних стимулировать увеличение массы изолированных семядолей. Для этого семена огурца сорта Успех замачивали на 2 ч в воде, затем высевали в кювету и проращивали в термостате при 28 оС. Через 6 сут при слабом освещении семядоли снимали, взвешивали по 10 шт. (выравнивая пробы по массе) и помещали в чашки Петри с экстрактами хроматограмм. Биотестировали в термостате при 28 оС в течение 1 сут, после чего семядоли взвешивали.

Для оценки активности АБК в чашки Петри раскладывали по 15 семян горчицы сорта Сарептская, которые заливали экстрактом хроматограмм (3-5 мл) и выдерживали в темновом термостате в течение 15-17 ч при 22-24 оС. О содержании АБК судили по процентному соотношению числа проросших семян в опыте и контроле.

Всхожесть семян, массу сухого вещества, длину побегов и корней, а также морфологические признаки конусов нарастания оценивали у проростков гречихи в возрасте 8 сут. Средние арифметические значения и стандартные ошибки представлены по трем биологическим повторностям.

Для определения продуктивности растений гречихи подсчитывали количество плодов на одном растении и массу 1000 семян. Выборка генеральной совокупности включала 41-49 вариантов. Число классов (k) для контрольной выборки определяли по правилу Старджеса: k = 1 + 3,3 logn, где n -- объем выборки. Величину классового интервала оценивали по соотношению степени варьирования признака и числа классов:

.

Для удобства сравнения классовый интервал для всех выборок был одинаковым и соответствовал контролю. При построении эмпирических кривых распределения частоту варьирования семенной продуктивности определяли по числу вариантов выборки, входящих в границы рассматриваемого класса. Теоретическую частоту при построении кривых нормального распределения рассчитывали по уравнению

где -- искомая ордината кривой (теоретическая частота); n - объем выборки; i -- классовый интервал; х -- значение признака в выборке, для которого определяли теоретическую частоту; М -- выборочная медия; -- среднее квадратическое отклонение. Соответствие эмпирического и нормального распределения выявляли по критерию 2 (13).

Результаты. При воздействии ИД на 2-суточные проростки гречихи наблюдалось снижение содержания в последних АБК (на 23-75 %) и ИУК (на 8-18 %), а также повышение содержания зеатина (на 20-87 %) (рис. 1а). Снижение содержания АБК вызвано подавлением синтеза гормона, а ИУК -- нарушениями метаболизма азота, так как при стрессе в клетках возрастает количество пероксидаз, являющихся компонентами ауксиноксидаз (1, 14). Повышение содержания зеатина свидетельствует об увеличении проницаемости клеточных мембран и активации клеточных делений (14).

Содержание ГА3 зависело от интенсивности стрессового воздействия: уменьшалось при ИД 11 и 23 МПа и возрастало при амплитуде 29 МПа. Последнее обстоятельство может быть косвенно обусловлено возрастанием содержания АБК в предшествующие периоды. Подтверждением этому служит тот факт, что всхожесть растений в опыте была значительно меньше, чем в контроле, и составляла 3-20 % (табл. 1).

1. Доля проросших семян гречихи на различных сроках выращивания под влиянием импульсного давления разной интенсивности (%)

На ячмене было показано, что АБК и ГА3 являются антагонистами в отношении роста и деления клеток, процессов клеточной дифференциации, синтеза РНК и белков (14). Мы предположили, что уменьшение содержания ГА3 при ИД 11 и 23 МПа вызвано запуском синтеза гидролаз в более ранние сроки (в возрасте менее 2 сут). Обратное соотношение ГА3 и АБК при ИД 29 МПа свидетельствует о том, что синтез ферментов ранее был нарушен, а затем восстанавливается, то есть через некоторое время следует ожидать усиления роста. При низкой амплитуде воздействия восстановление наступает раньше, чем при высокой, что согласуется с данными других исследователей (1).

У 8-суточных проростков содержание АБК после обработки ИД возрастало в 2,5-2,8 раза относительно контроля. По данным литературы, содержание АБК у растений при стрессе существенно варьирует, причем максимум отмечен в возрасте проростков 24 ч и 7-8 сут (14). Изменение синтеза фитогормонов под влиянием ИД носило не эпизодический характер, а продолжительное время оказывало воздействие на физиологические процессы (табл. 2). Так, повышение содержания АБК сопровождалось замедлением ростовых процессов в возрасте проростков гречихи 8 и 11 сут.

Содержание зеатина у 8-суточных проростков возрастало на 10-34 % (см. рис. 1б). Известно, что эквимолярное содержание АБК и зеатина устраняет антагонизм между этими соединениями. В наших опытах наблюдалось значительное превышение концентрации АБК относительно зеатина, что вызывало торможение физиологических процессов.

Снижение содержания ИУК на 30 % при ИД 23 МПа и повышение содержания зеатина у 2- и 8-суточных проростков гречихи способствовало ослаблению апикального доминирования и инициированию закладки примордиев в конусе нарастания. Содержание ГА3 возрастало на 41 % при интенсивности ИД 23 МПа и снижалось на 25 и 36,4 % при ИД соответственно 29 и 11 МПа. Увеличение содержания ГА3 и зеатина активировало деление конуса нарастания и рост стебля (см. табл. 2). У 11-суточных побегов при ИД 11 и 23 МПа содержание АБК уменьшалось соответственно

2. Морфометрические показатели проростков гречихи на различных сроках выращивания под влиянием импульсного давления разной интенсивности