Степень выраженности эндотоксикоза в плазме крови изучали по уровню среднемолекулярных пептидов (СМП), одних из наиболее токсичных, конечных субстанций процессов гидролиза крови излившейся в просвет кишечника [Малахова М.Я., 1995] и, продуктов перекисного окисления липидов (ППОЛ) - диеновых коньюгатов (первичных) [Биленко М.В., 1997] и малоновых диальдегидов (вторичных) [Владимиров Ю.А, 1991]. Антиоксидантную активность исследовали по значениям фермента супероксиддисмутазы [Костюк В.А, 1990]. Для отражения процессов окислительного стресса определяли состояние баланса регуляционной системы оксиданты-антиоксиданты на основе расчета оксидантно-антиоксидантного отношения (О/Аотн), через отношение показателей диеновых коньюгатов к уровню супероксиддисмутазы [Климович И.Н., Патент РФ №2444013. - 2012]. I степень нарушения 3,64-5,64 усл.ед, II степень 5,65-8,12 усл.ед и III степень > 8,12 усл.ед.
кровотечение кишка язвенный поджелудочный
При помощи модульной формулы (1) [Петри А., Сэбин К., 2009] вычисляли суммарный индекс эндотоксикоза (СИЭ) в баллах:
где n - число исследований; m1 + m2 +... +mn - показатели эндотоксикоза, выраженные в % по отношению к средним значениям у интактных животных.
I степень эндотоксикоза соответствовала 0,1-3,1 баллам; II степень - 3,2-8,3 баллам; III степень > 8,3 баллов.
Производили изъятие тонкой кишки для морфологических исследований. Изготовление микропрепаратов и общегистологические исследования, проводили по общепринятым методикам [Саркисов Д.С., 1996]. Для большей информативности структурных изменений, также по модульной формуле (1) проводилась балльная суммарная оценка морфометрических нарушений. I степень морфометрических нарушений соответствовала 0,7-2,1 баллам; II степень - 2,2-7,7 баллам; III степень > 7,8 баллов. Использованная нами модель тяжелых кровотечений из верхних отделов ЖКТ, наиболее приближена к клиническим ситуациям (эксфузия крови в ЖКТ с негативными последствиями гидролиза крови; реанимация с применением донорской крови, обеспечивающей процессы реперфузии в стенке тонкой кишки).
Клиническое проспективное когортное исследование, в периоде с 2013 по 2016 год, проведено у 129 больных с острыми кровотечениями из гастродуоденальных язв (ГДЯ), находившихся на лечении в хирургических отделениях ГБУЗ «ГКБ СМП №25», ГБУЗ «КБ №5», ГБУЗ «КБ №12» г. Волгограда и ГБУЗ «ГКБ №1 им. С.З. Фишера» г. Волжский. У всех пациентов гемостаз достигнут или проведена профилактика рецидива состоявшегося кровотечения эндоскопическим инъекционным способом (этоксисклерол, адреналин). На основании данных исследований были установлены клинико-лабораторно-инструментальные критерии развития СКН, частота и предикторы его формирования, определены место СКН в патогенезе системного эндотоксикоза и связь с СД (печень и почки).
СКН не был обнаружен ни у одного из 57 (57/129 - 44,2%) больных c I и II ст. тяжести кровопотери, вследствие чего набор этой категории пациентов для дальнейших исследований был прекращен и они не включались в общую статистику (табл. 1). СКН диагностирован в 42 (42/72 - 58,3%) случаях и только среди 72 пациентов с тяжелыми степенями кровотечения (III-IV), вследствие чего эти больные и составили группу сравнения.
Диагностическую и лечебную тактику рассматривали в 2-х статистически однородных группах. Основная группа 74 больных, у которых были проведены разработанные нами лечебно-профилактические мероприятия СКН с 2016 по 2019 гг.
Комплексное клинико-инструментальное обследование больных проводилось в 1-2 сут, 3-4 сут, 5-6 и 7-8 сут с момента поступления больных в стационар. Лабораторные исследования степени выраженности эндотоксикоза, функционального состояние печени и почек, вычисление SAPS, как более динамичных проводилось в 1, 2, 3, 4, 5 и 6-8 сут. Реалибитационный период прослеживался до 1 месяца. Обязательным условием включения больных в группы являлось их согласие на проведение исследования.
Для стандартизации полученных данных, а также с целью последующей статистической обработки, была использована разработанная "Индивидуальная карта больного" в электронном формате. У всех больных определяли клинические симптомы СКН: отсутствия кишечных шумов или их резкого ослабление, вздутия живота, боли в животе с чувством распирания, сниженный пассаж флатуленции, отсутствие самостоятельного стула. Методики контроля уровня выраженности эндотоксикоза описаны в разделе «Экспериментальные исследования». Дополнительно в качестве одного из параметров эндотоксемии определяли проницаемость эритроцитарных мембран по степени мочевинного гемолиза эритроцитов (ПЭМ) [Колмаков В.Н., 1982]. Проницаемость эритроцитарных мембран значительно увеличивается при токсическом воздействии на нее. Для ФГДС использовались серийные терапевтические эзофогогастродуоденоскопы «Pentax» серий 29V и 29W; «Olympus GiF E» (Япония). Игла эндоскопическая инъекционная предприятия «Ворсма» (Россия). В качестве эндовазально вводимого склерозанта применялся этоксисклерол (полидоканол) 1,5%, спиртовой в объеме 2,0-4,0 мл. Аналогичный раствор вводился паравазально в объеме до 4,0 мл. Для создания сдавливающего паравазального инфильтрата использовался раствор адреналина гидрохлорида 0,01% - 1,0 мл, который доводили до объема от 30 - 60 мл изотоническим раствором 0,9% хлорида натрия. Моторно-эвакуаторные функции ЖКТ исследовались электрогастроэнтерографом ЭГЭГ-01К. Ультразвуковое исследование тонкой кишки выполнялось на аппаратах «HITACHI - EUB - 305» и «Siemens Sonoline G60s». Состояния кишечной микрофлоры изучалось в бактериологических лабораториях ГБУЗ «ВОКБ № 1» г. Волгограда и ГБУЗ «ВОКБ № 2» г. Волжский по критериям предложенным Бондаренко В.П. в 1998 году (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, РАМН, г. Москва). Микроскопическое исследование кала проводили по стандартной методике [Миронова И.И., 2005].
Для объективной интегральной и количественной оценки острых функциональных нарушений использовалась упрощенная шкала SAPS (Simplified Acute Physiological Score) (J. Le Gall и соавт., 1993). Диссертационная работа была выполнена в дизайне многоцентрового когортного исследования с ограниченной внешней валидностью, что соответствует второму уровню доказательности согласно Оксфордской градации (2009).
Степень надежности предложенных практических рекомендаций соответствует В-уровню (Оксфордская градация, 2009). В экспериментальной части работы использованы методы непараметрической ранговой статистики. Данные по группам представлены в виде медианы и интерквартильного диапазона (Me (Q25; Q75). Для оценки достоверности различий определялось значение U-критерия Манна-Уитни. В клинической части работы использовали параметрические способы статистической обработки материала. Формирование исследуемых групп осуществляли методом случайной выборки, придерживаясь в комплектовании принципов однородности представленного материала. Расчеты сплошного и несплошного статистического наблюдения произведены на персональном компьютере IBM PC с помощью программ Excel 2013 и «Biostat» с использованием сравнения средних величин и расчетом критериев Стьюдента и Фишера. Использовался одномерный метод ранговой корреляции Спирмена для выявления связей между переменными, отобранными для анализа (rs). Различие в показателях считали статистически достоверным при p?0.05.
Результаты исследований и их обсуждение Экспериментальные исследования
Результаты экспериментальных исследований рассматривались с позиции - роль пораженной тонкой кишки в потенцировании эндотоксикоза при тяжелых кровотечений из верхних отделов ЖКТ. Результаты исследования показали, что уже через 4 ч от начала эксперимента у животных наблюдались последствия ишемически-реперфузионного поражения стенки кишки (р<0,05). Данные оксидантно-антиоксидантного отношения свидетельствовали об окислительном стрессе в тканях стенки кишки (р<0,05). При этом незначительное, в равной степени повышение уровня СМП в периферической венозной крови и в крови, оттекающей от кишечника (рис. 1), как и степень морфоструктурных нарушений (дистрофическое изменение энтероцитов слизистого слоя, без их десквамации), говорило о еще сохраняющейся «барьерной» функции стенки тонкой кишки. Степень морфоструктурных нарушений достигала 1,9±0,2 балла (I ст.).
Уже в первые часы от начала эксперимента, обнаружена значительная полиморфноклеточная лейкоцитарная инфильтрация всех слоев стенки тонкой кишки, свидетельствующая о выраженной воспалительной реакции в ней. Однако через 16 ч полученные данные свидетельствовали о развитии кишечной недостаточности, сопровождающейся нарушением «барьерной» функции стенки кишки и наводнении портальной крови внутрикишечными продуктами дисметаболизма (преимущественно СМП). Это подтверждено и морфологическим исследованием, при котором обнаружена гибель энтероцитов на отдельных участках слизистого слоя с образованием поверхностных эрозий, обнажающих базальную мембрану. Морфометрическое исследование показало повышение степени структурных нарушений до 6,5±0,3 баллов (II ст.).
Через 28 ч от начала эксперимента показатели выраженности эндотоксикоза возрастали, как и морфоструктурные изменения в стенке тонкой кишки. Однако разница в уровне эндотоксикоза в различных регионах кровотока существенно уменьшалась, вероятнее всего за счет «насыщения» периферического русла внутрикишечными токсинами. Сохранялись различия лишь в показателях оксидантно-антиоксидантного отношения, как наиболее чувствительных к окислительному стрессу. У всех экспериментальных животных к завершению эксперимента в периферическом венозном кровотоке, а особенно в крови, оттекающей от кишечника, наблюдалось снижение супероксиддисмутазы в 2-2,8 раза от нормы (р?0,05), что указывало на истощение антиоксидантной активности плазмы крови. Вероятнее всего, это связанное с повышенным потреблением фермента на ингибирование избыточных процессов свободнорадикального окисления липидов в клетках стенки тонкой кишки. Медиана морфометрических изменения достигала - 8,7±0,4 баллов (III ст.)
На всем протяжении эксперимента, корреляционный анализ между СИЭ и морфометрией стенки тонкой кишки выявил, что уровень эндотоксикоза в крови, оттекающей от кишечника, зависит от степени повреждения структуры стенки кишки и имеет прямую корреляционную зависимость (rs в пределах 0,764-0,956) по всем позициям (табл. 2).
К завершению эксперимента обнаруженные корреляционные связи усиливались. Таким образом, на экспериментальных моделях с кровотечениями из верхних отделов ЖКТ, определена негативная роль кишечной недостаточности в потенцировании системного эндотоксикоза. Сразу после появления признаков нарушения целостности слизистого слоя тонкой кишки, в крови, оттекающей от кишечника, наблюдается достоверно (р<0,05) более высокий уровень эндотоксемии, чем в периферической венозной крови. Высокотоксичная кровь, оттекающая от пораженного кишечника, существенно наращивает системный эндотоксикоз (р<0,05). В свою очередь окислительный стресс в стенке кишки, в результате ишемии-реперфузии, приводит к воспалительным процессам в ней, сопровождающимися инфильтрацией ее полиморфноклеточными нейтрофилами, которые дополнительно генерируют реактивные кислородные метаболиты, преумножая повреждение мембран энтероцитов.
Клинические исследования
У 72 больных с тяжелыми гастродуоденальными кровотечениями (III-IV ст.), поступивших в клиники с 2013 по 2016 годы проведено параллельное мониторирование клинической картины, электрогастроэнтерографии, сонографии тонкой кишки, лабораторных данных, микроскопического и бактериологического исследования кала. О развитии СКН судили по: 1) по клинической картине (отсутствие кишечных шумов или их резкое ослабление, вздутие живота, боли в животе с чувством распирания, сниженный пассаж флатуленции, отсутствие самостоятельного стула); 2) данным электрогастроэнтерографии (снижение суммарной мощности электрического сигнала, разбалансировка ритма импульсаций всех отделов ЖКТ; 3) данным сонографии тонкой кишки (увеличение диаметра тонкой кишки и ширины ее стенки, снижение или отсутствие перистальтики, депонирование газа и жидкости в просвете тонкой кишки); 4) микроскопическое исследование кала (большое количество слущенных групп клеток покровного цилиндрического эпителия слизистой кишки в результате ишемически-реперфузионного поражения); 5) бактериологическое исследование кала (изменения видового и количественного состава микрофлоры кала в сторону патогенных и условно-патогенных форм).
Формирование СКН считали достоверным при одновременном свидетельстве всех вышеперечисленных методов/способов его диагностики. СКН сопровождал заболевание в 42 (42/72 - 58,3%) случаях. У пациентов с III ст. тяжести кровотечения в 34 (34/64 - 53%) и IV ст. в 8 (8/8 - 100%). СКН получал развитие через 12-24 часа после госпитализации, т.е. с момента остановки кровотечения и/или выведения из геморрагической гипотензии и восстановления ОЦК (объема циркулирующей крови). Вслед за ишемическим повреждением кишечной стенки на догоспитальном этапе, в процессе первых часов интенсивной терапии наступает ее реперфузионное поражение, которое «обеспечивали» - подъем артериального давления до нормальных цифр, инфузия эритроцитарной массы (богатой молекулярным кислородом) и кислородная дыхательная поддержка. СКН наиболее ярко проявлялся в 1-4 сут стационарного лечения, а положительная тенденция начинала отмечаться лишь с 5-6 суток.
Исследования эндотоксикоза показали, что начиная с первых суток после кровопотери тяжелой степени, у пациентов с СКН наблюдаются последствия ишемически-реперфузионного поражения стенки кишки. У больных с СКН, значительный дисбаланс между наработкой ППОЛ и дефицитом супероксиддисмутазы, свидетельствует об окислительном стрессе в тканях стенки тонкой кишки, приводящего к гибели клеток эпителия слизистого слоя кишки и развитию ее недостаточности (табл. 3). В течение 1 сут «барьерная» функция стенки тонкой кишки сохраняется, что подтверждается равномерным повышением уровня СМП у больных с СКН и без СКН.
У больных без СКН на 2-3 сут показатели эндотоксикоза и антиоксидантной активности стабилизируются и к 4 сут происходит их нормализация. У пациентов с СКН на 2 сут происходит резкое увеличение концентрации СМП в плазме крови, что свидетельствует о нарушении «барьерной» функции стенки кишки и наводнении центрального кровотока наряду с ППОЛ, токсичными субстанциями процессов гидролиза крови излившейся в просвет кишечника. Высокий уровень эндотоксикоза в крови сохраняется в течение 3-4 сут с момента госпитализации, так как продолжает «поддерживаться» поступлением большого количества СМП и ППОЛ из пораженной тонкой кишки. Рассчитываемое оксидантно-антиоксидантное отношение (отношение диеновых коньюгатов к уровню супероксиддисмутазы), наиболее более точно отражает самую раннюю стадию окисления полиненасыщенных жирных кислот, составляющих основу клеточных мембран организма (р>0,05). Резкое повышение оксидантно-антиоксидантного отношения может свидетельствовать о массовой гибели клеток тонкой кишки.