- выделение мононуклеарных клеток (МНК) из образцов эндометриальной ткани выполнялось механическим бесферментативным методом с помощью скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколла-урографина (d = 1,078);
- определение фенотипа и внутриклеточного синтеза цитокинов эндометриальными лимфоцитами с помощью моноклональных антител (мАТ) -- методом двухцветной проточной цитофлюориметрии на приборе «FACScan» («Becton Dickinson», USA). В исследовании использовали следующие мАТ: конъюгированные с FITC анти-CD56 («Beckman Coulter», France), конъюгированные с РЕ анти-CD158a («Beckman Coulter», France), анти-CD158i («Beckman Coulter», France). Внутриклеточную продукцию цитокинов оценивали с помощью следующих мАТ: конъюгированные с РЕ анти-human-IFNг («Becton Dickinson», USA) и анти-human-TGFв1 («Becton Dickinson», USA).
- определение экспрессии мРНК TGF1 в ткани миометрия и в миоматозных узлах -- методом количественной полимеразной цепной реакции (RT-PCR) в масштабе реального времени на амплификаторе
- с оптической насадкой «iCycler iQ» («BIO RAD», USA).
Морфологические методы исследования. Производилась обзорная гистология эндометрия и миометрия. Препараты фиксировались в 10%-ном нейтральном формалине в течение 72 часов. После стандартной парафиновой проводки готовились срезы толщиной 4-5 мкм, окрашивались гематоксилином
Эрлиха с докраской эозином и заключались в бальзам. В обзорных препаратах изучалась межуточная ткань, сосудистое русло и мышечный компонент миометрия.
Иммуногистохимические исследования проводили с применением первичных антител к сосудисто-эндотелиальному фактору роста (anti-VEGF-A, Dako, клон VG1, рабочее разведение 1: 50). Реакцию осуществляли на парафиновых срезах после предварительной демаскировки антигена путем кипячения в Трис-ЭДТА буфере pH = 9,0 в течение 15 минут. Использовали систему визуализации «LSAB2 System HRP» («Dako», USA) по протоколу производителя. Иммуногистохимическую реакцию оценивали путем подсчета индекса экспрессии Histoscore в 5 полях зрения при увеличении Ч 400. Определяли количество VEGF-положительных капилляров и интрамуральных артерий, высчитывали плотность распределения сосудов в 1 мм2.
Статистическая обработка данных проводилась по общепринятым методам вариационной статистики после проверки рядов на нормальность распределения. В зависимости от типа распределения данных достоверность различий между показателями независимых выборок оценивались по непараметрическому U-критерию Манна - Уитни или по t-критерию Стьюдента (M ± m). Для оценки факторов риска быстрого роста ЛММ рассчитывали относительный риск (ОР) с 95%-ным доверительным интервалом (ДИ -- 95%). Статистический анализ осуществлялся в пакете прикладных лицензионных программ «Statistica 6.0», «Microsoft Office 2007», «MedCalk», «GenStat» и «Open Epi».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Под наблюдение были взяты пациентки в возрасте от 24 до 45 лет. Средний возраст женщин первой группы составил 40,6 ± 0,6 года; второй -- 40,4 ± 0,5 года; группы контроля -- 37,7 ± 1,3 года, достоверных различий по возрастному составу между группами не выявлено.
Анамнез пациенток с ЛММ достоверно чаще, чем у женщин контрольной группы, был отягощен частыми респираторными заболеваниями (73,9 и 38,7% соответственно, р = 0,000). В структуре экстрагенитальной патологии, выявленной на момент обращения, у женщин с ЛММ по сравнению с контрольной группой преобладали железодефицитная анемия (43,6 против 0,0%, р = 0,000 соответственно), варикозная болезнь нижних конечностей (34,0 и 3,2% соответственно, ОР 1,42; 95%; ДИ 1,22--1,65, р = 0,000), артериальная гипертензия (32,9 и 6,5% соответственно, ОР 1,36; 95%; ДИ 1,15--1,59, р = 0,002), ожирение (28,7 и 3,2% соответственно, ОР 1,38; 95%; ДИ 1,22--1,65, р = 0,001), хронический рецидивирующий назолабиальный герпес (26,6 и 9,7% соответственно, ОР 1,26; 95%; ДИ 1,1--1,5; р = 0,02), хронический холецистит (19,1 и 0,0% соответственно, ОР 1,4; 95%; ДИ 1,24--1,57, р = 0,004), остеохондроз позвоночника (19,1 и 3,2% соответственно, р = 0,02), хронический бронхит (17,0 и 3,2% соответственно, ОР 1,3; 95%; ДИ 1,1--1,53, р = 0,04). Следует отметить, что такие заболевания, как железодефицитная анемия (53,2 и 34,0% соответственно, р = 0,01), ожирение (35,9 и 13,3% соответственно, ОР 1,37; 95%; ДИ 1,1--1,74; p = 0,02), варикозная болезнь нижних конечностей (39,1 и 23,3% соответственно, ОР 1,3; 95%; ДИ 1,01--1,67, р = 0,04), хронический рецидивирующий назолабиальный герпес (31,6 и 16,7% соответственно, ОР 1,28; 95%; ДИ 1,01--1,65, р = 0,04) у женщин с быстрорастущей ЛММ выявлялись значительно чаще, чем у пациенток с ЛММ стабильно малых размеров. Отягощенность соматического статуса больных с ЛММ экстрагенитальной патологией, выявленной в нашем исследовании, согласуется с данными литературы (Сидорова И. С., 2002; Вихляева Е. М., 2004; Щербакова Л. А. и др., 2012; Okolo S. еt аl., 2008).
Нами не было обнаружено различий в становлении менструальной функции у женщин в зависимости от темпа роста опухоли. У пациенток с ЛММ значительно чаще отмечались нарушения менструальной функции в виде гиперполименореи и дисменореи. Менструальная функция женщин с быстрым ростом ЛММ по сравнению с пациентками с ЛММ стабильно малых размеров отличалась увеличением средней продолжительности менструации до 5,7 ± 0,2 дней (р = 0,01).
Репродуктивный анамнез больных с ЛММ по сравнению с контрольной группой характеризовался большой частотой самопроизвольных выкидышей в ранние сроки беременности (20,8 и 3,2% соответственно, р = 0,014), медицинских абортов (65,6 и 48,4% соответственно, р = 0,047), меньшей частотой своевременных родов (88,5 и 100,0% соответственно, р = 0,036). В то же время у пациенток с ЛММ значительно чаще отмечалось бесплодие (21,9 и 0,0% соответственно, p = 0,001). Таким образом, женщины с ЛММ имели в анамнезе факторы, нарушающие целостность эндометрия, что, по мнению А. Л. Тихомирова (2004, 2006), наряду с инфекцией может служить триггерным фактором формирования миоматозного узла. Незначительное число женщин с ЛММ в отличие от контрольной группы использовали гормональную контрацепцию (9,4 и 29,0% соответственно, ОР 1,6; 95%; ДИ 1,01--2,56; p = 0,01), причем реже всех -- женщины с быстрым ростом опухоли по сравнению с ЛММ стабильно малых размеров (4,5 и 20% соответственно, ОР 2,17; 95%; ДИ 1,01--2,52; p = 0,024). Между тем применение низкодозированных КОК, по мнению некоторых исследователей, является надежным средством профилактики формирования и прогрессирования ЛММ (Тихомиров А. Л. и др., 2011).
В структуре перенесенной гинекологической патологии у женщин с ЛММ по сравнению с группой контроля преобладали воспалительные заболевания придатков матки (58,3 и 19,4% соответственно, ОР 1,5; 95%; ДИ 1,2--1,8; р = 0,000), неопухолевых заболеваний шейки матки (47,9 и 6,5% соответственно, ОР 1,5; 95%; ДИ 1,2--1,8; р = 0,000), что свидетельствует о роли инфекционно-воспалительного фактора в формировании ЛММ (Тихомиров А. Л. и др., 2006).
Таким образом, клинико-анамнестическими факторами риска быстрого роста ЛММ у женщин репродуктивного возраста являются сочетание основного заболевания с ожирением (ОР 1,37), хроническим назолабиальным герпесом (ОР 1,28), варикозной болезнью нижних конечностей (ОР 1,3). Фактором, снижающим риск быстрого роста ЛММ, является использование с целью контрацепции КОК (ОР 0,46).
Пациенткам с ЛММ выполнена гистероскопия, в ходе которой было исключено сочетание основного заболевания с внутренним эндометриозом и произведено раздельное диагностическое выскабливание с последующим гистологическим исследованием эндометрия. У 37,5% женщин был выявлен доброкачественный гиперпластический процесс эндометрия, в основном в виде железисто-кистозной гиперплазии эндометрия, что было достоверно чаще, чем в группе контроля (30,2 и 0,0% соответственно, р = 0,000).
Клиническое течение основного заболевания женщин с быстрорастущей ЛММ, в отличие от пациенток с ЛММ стабильно малых размеров, имело свои особенности. За последний год наблюдения у женщин данной группы отмечалось увеличение размеров матки на 4-10 недель беременности. К моменту
обследования размеры матки вместе с миоматозными узлами соответствовали 10-20 неделям беременности. В данной группе опухоль имела, как правило, множественный характер (79,4 и 41,6% соответственно, р = 0,01). Большинство пациенток предъявляли жалобы на нарушение менструальной функции по типу гиперполименореи (70,6 и 45,8% соответственно, р = 0,01), а также отмечали наличие болевого синдрома (38,2 и 4,2% соответственно, р = 0,000) и дизурических явлений (20,6 и 0,0% соответственно, р = 0,002).
Все женщины второй клинической группы подвергались оперативному лечению, показаниями к которому служили быстрый рост опухоли, гиперполименорея, приводящая к анемии, болевой синдром, нарушение функции смежных органов. Объем оперативного вмешательства был следующим: у 69,7% больных была выполнена субтотальная гистерэктомия, у 6,1% -- тотальная гистерэктомия, у 24,2% -- миомэктомия ввиду молодого возраста и нереализованной репродуктивной функции. По данным гистологического исследования операционного материала у всех пациенток была установлена лейомиома матки, причем у 27 (40,9%) больных имели место явления пролиферации гладкомышечных волокон, на основании чего эти пациентки отнесены в подгруппу с «истинным» типом роста опухоли. 39 (59,1%) женщин с выраженными дистрофическими изменениями узлов (отек, гиалиноз, склероз, некроз) составили подгруппу с «ложным» типом роста опухоли.
Для оценки клинической эффективности применения аГнРГ нами была сформирована группа из пациенток с быстрорастущей ЛММ, которым ввиду нереализованной репродуктивной функции было показано органосохраняющее оперативное лечение. Средний возраст женщин составил 34,8 ± 1,2 года. По особенностям преморбидного фона пациентки данной группы во многом были схожи с группой женщин с быстрорастущей ЛММ. Особенностью анамнеза этих женщин была высокая частота бесплодия (53,3%), что согласуется с данными других авторов (Вихляева Е. М., 2004; Khaund А. еt аl., 2008; Sankaran S. еt аl., 2008). Репродуктивная функция была реализована лишь у 60,0% пациенток.
Основными клиническими параметрами эффективности предоперационной терапии являлись: уменьшение размеров матки и миоматозных узлов по данным УЗИ и тяжести клинических симптомов основного заболевания.
На фоне проводимой терапии произошло изменение характера жалоб. Ведущими жалобами до лечения были: нарушение менструальной функции по типу гиперполименореи -- у 10 (66,7%), боли внизу живота и поясничной области -- у 4 (26,7%), дизурические расстройства -- у 4 женщин (26,7%).
После лечения стали преобладать жалобы, связанные с эстрогендефицитным состоянием -- у 5 (33,3%) пациенток. Приливы и потливость появились у 3 (20,0%), нарушение сна -- у 2 (13,3%), эмоционального фона -- у 3 (20,0%). На фоне лечения менструации отсутствовали, не был отмечен болевой синдром. При дальнейшем наблюдении менструации у всех пациенток были умеренными, безболезненными. Симптомы, связанные с пониженным эстрогенным фоном, регрессировали в течение 1-2 месяцев.
На фоне лечения аГнРГ уменьшение размеров матки и миоматозных узлов по данным УЗИ наблюдалось практически у всех женщин (93,3%).
Отсутствие изменений в объеме доминантного узла выявлено лишь у 1 пациентки (6,7%). Уменьшение объема матки в среднем произошло на 35,4% (р = 0,000), а доминантного миоматозного узла -- на 35,2% (р = 0,000). Курс лечения сопровождался повышением средней концентрации гемоглобина на 13,3% (р = 0,000), количество эритроцитов увеличилось на 9,1% (р = 0,008) Операция не вызывала технических затруднений, за исключением 1 случая (наличие более 20 миоматозных узлов).
По данным гистологического исследования операционного материала у всех пациенток была установлена лейомиома матки, причем активно пролиферирующие опухоли составили 20,0% (3), очагово пролиферирующие 20,0% (3) и стационарные без признаков пролиферации, но с выраженными субтотальными или тотальными дистрофическими изменениями -- 60,0% (9).
Послеоперационная реабилитация является важнейшим этапом предгравидарной подготовки пациенток после миомэктомии. Она направлена на профилактику рецидива заболевания, нормализацию кровотока в маточных артериях, лечение анемии, формирование полноценного рубца на матке (Баринов С. В., 2008; Буянова С. Н., 2012). С целью профилактики рецидива ЛММ всем пациенткам в течение 3 месяцев назначены аГнРГ. После оперативного лечения женщины наблюдались в течение 1 года.
Появление новых миоматозных узлов, по данным УЗИ, обнаружено у 1 женщины (6,7%) через 1 год после оперативного лечения.
Маточная беременность самостоятельно наступила у 4 пациенток (26,7%): 3 (20,0%) из них сохраняют беременность, у 1 (6,7%) произошло самопроизвольное прерывание беременности в ранние сроки.
Проведенные ранее исследования свидетельствуют о значительных
иммунных нарушениях, на фоне которых происходит развитие и рост ЛММ. Однако до сих пор остаются недостаточно изученными механизмы регуляции системного и локального иммунного ответа у женщин с ЛММ в зависимости от темпа и морфологических типов роста опухоли.
Установлено, что у пациенток с ЛММ независимо от темпа роста опухоли в эндометрии повышалось содержание ЕК (27,5 ± 2,19% -- контрольная группа, 35,4 ± 1,14% -- ЛММ, р = 0, 000); а также уровень ЕК, экспрессирующих активирующие рецепторы CD158i+ (4,52 ± 0,66% -- контрольная группа, 7,43 ± 0,61% -- ЛММ, р = 0,002) и ингибирующие рецепторы CD158a+ (4,86 ± 0,7% -- контрольная группа, 8,14 ± 0,5% --ЛММ, р = 0,000). Как известно, основная функция ЕК -- цитотоксическая активность в отношении трансформированных и инфицированных вирусами клеток (Ярилин А. А., 2010; Абакушина Е. В. и др., 2012; Cooper M. A. еt аl., 2001; Cella M. еt аl., 2009).
Наши данные о высоком содержании ЕК в эндометрии согласуются с полученными ранее результатами у женщин с ЛММ (Новикова Е. Н. и др., 2008), что позволяет судить о реакции иммунной системы на появление в миометрии трансформированных клеток. Функция KIR рецепторов заключается в активации или ингибировании цитотоксических реакций ЕК (Ярилин А. А., 2010; Абакушина Е. В. и др., 2012; Gati A. еt аl., 2003; Hanna J. еt аl., 2004; Jobim M. еt аl., 2008; Mulrooney T. J. еt аl., 2013). Нарушение баланса в экспрессии рецепторов может приводить к нарушению элиминирующей функции ЕК в отношении опухолевых клеток и микробных агентов.
Быстрый рост ЛММ был ассоциирован с увеличением в периферической крови уровня ЕК (16,24 ± 1,47% -- контрольная группа, 17,78 ± 1,03 -- ЛММ стабильно малых размеров, 21,16 ± 1,05% -- быстрорастущая ЛММ, р = 0,01 и р = 0,03 соответственно), уровня ЕК-Т клеток (3,75 ± 0,45% -- контрольная группа, 3,61 ± 0,46 -- ЛММ стабильно малых размеров, 5,41 ± 0,34% -- быстрорастущая ЛММ, р = 0,007 и р = 0,003 соответственно), а также со снижением в эндометрии количества ЕК-Т клеток, экспрессирующих активирующие CD158i+ рецепторы (4,38 ± 0,81% -- контрольная группа, 3,06 ± 0,26 -- ЛММ стабильно малых размеров, 2,39 ± 0,32% -- быстрорастущая ЛММ, р = 0,028 и р = 0,002 соответственно) и ингибирующие CD158а+ рецепторы (7,49 ± 0,83% -- контрольная группа, 4,89 ± 0,47 -- ЛММ стабильно малых размеров, 2,96 ± 0,43% -- быстрорастущая ЛММ, р = 0,000 и р=0,006). Известно, что