Материал: Применение поверхностного плазмонного резонанса в сенсорных системах

Рисунок 9 - Идеализированная схема наблюдения ППР с пучком света, расходящимся от точечного источника S

Если линейка фотодетекторов расположена ортогонально к направлению распространения отраженного света, то

(23.7)

где  - размер отдельного фотодетектора в плоскости отражения;  - полный путь, который проходит свет от вершины расходящегося пучка света до линейки фотодетекторов.

Если учесть также немонохроматичность света, то суммарная физическая угловая разрешающая способность в оптической схеме с расходящимся пучком света составляет

(23.8)

Использованные здесь обозначения расшифрованы выше.

В модулях Spreeta, например, размер одного элемента фотодетектора составляет , базовое расстояние , AlGaAs-светодиод излучает свет с длиной волны  = 830 нм,  = 15 нм и  = 64 . Размывание кривой ППР составляет около 2 . Т.е. именно оно определяет в этих модулях почти всю ширину резонансной полосы.

3. Применение ППР сенсоров

.1 Применение ППР для биохимических анализов

В 80-х годах ХХ в. выяснилось, что ППР может стать и чувствительным методом выявления присутствия даже незначительного количества разных биологических примесей. Для этого на внешней поверхности тонкой золотой пленки биохимическими методами высаживают ("иммобилизуют") мономолекулярный слой " лиганда " или " рецептора ". Это слой органических молекул, которые избирательно взаимодействуют с "аналитом" - теми молекулами (частицами), концентрацию которых в растворе мы хотим измерять.

- прозрачная среда с высоким показателем преломления; 2 - тонкая металлическая пленка; 3 - чувствительный слой лиганда; 4 - молекулы (частицы) аналита.

Рисунок 10 - Схема наблюдения сдвига кривой ППР при наличии аналита

Если в качестве "рецептора" используются молекулы или частицы биологического происхождения, то ППР сенсоры часто называют " ППРбиосенсорами ", а чувствительный слой - "биорецепторным" слоем. Различают две большие группы биорецепторных слоев: на основе ферментов и на основе антител. В последнем случае ППР сенсоры называют также " ППР иммуносенсорами ".

Когда молекулы (частицы) аналита присоединяются к молекулам лиганда (рецептора), создаваемое последними электрическое поле на поверхности металла несколько изменяется, вследствие чего резонансный минимум ППР смещается. Сдвиг этот тем больше, чем больше молекул (частиц) аналита присоединилось к биочувствительному слою лиганда. А это зависит от концентрации аналита в исследуемом растворе и от кинетики процессов биохимического взаимодействия аналита с лигандом.

Таким образом, измеряя величину сдвига минимума кривой ППР, в принципе стало возможным обнаруживать присутствие и измерять концентрацию в растворах многих важных биохимических веществ и микрочастиц (вирусов, бактерий, антител,...). А снимая зависимость величины сдвига от времени, можно изучать кинетику их биохимических взаимодействий и ее зависимость от различных факторов. Собственно, сам прецизионный биохимический анализ на молекулярном уровне выполняет в этом случае специфический чувствительный слой лиганда (биорецептора), нанесенного на поверхность металлической пленки, а метод ППР позволяет довольно точно "считывать" результаты этого анализа.

Перед такими чувствительными ППР биосенсорами открылась широкая область применений. Это - и научные исследования в области биохимии, и обнаружение опасных загрязнений, отравляющих и химически вредных примесей в питьевой воде, и контроль концентрации разных ингредиентов в молоке, пиве, вине, других напитках, в бензине и моторных маслах и т.п. Появилась возможность быстрого обнаружения вредных вирусов, бактерий, биохимических веществ в жидкостях, в том числе и в полевых условиях, а также возможность создания многих новых тонких методов научных исследований.

Чувствительностью ППР сенсора называют ту наименьшую концентрацию аналита, которую можно надежно зафиксировать с помощью этого сенсора. Чувствительность зависит от ряда факторов, в частности, от того, какая часть аналита уже связалась с рецепторным слоем. А это зависит от температуры и времени их взаимодействия. Но, пожалуй, определяющую роль играет тот минимальный угол сдвига кривой ППР, который можно надежно зафиксировать с помощью программно-технических средств сенсора.

ППР сенсоры с монохроматическим источником света, отслеживающие угловую зависимость интенсивности его отражения, можно разделить на два вида - работающие с параллельным и работающие с расходящимся световым пучком.

.2 Виды и конструкции сенсоров на ППР

Одним из наиболее известных ныне в мире промышленных ППР сенсоров является "BIACORE 3000" шведской фирмы Biacore AB, показанный на рисунке 12. Он состоит из мини-компьютера и сенсорного блока размерами 760x610x350 мм и массой до 50 кг. Рассчитанный на стационарное использование в лабораториях, он является наиболее высокопроизводительной и чувствительной исследовательской системой для изучения взаимодействия биохимических веществ. Чувствительность анализов достигает 1 пМ = 10^-12 моля. Допустимый диапазон изменения показателя преломления исследуемой жидкости - от 1,33 до 1,40.

В оптимальных условиях проведения экспериментов BIACORE 3000 позволяет зафиксировать сдвиг резонансного угла от 10 RU до 70000 RU. Специально введенная единица 1 RU (resonance unit - единица резонанса) эквивалентна сдвигу, вызываемому связыванием 1 пикограмма (10^-15 кг) протеина на 1 мм² чувствительной поверхности. Способность регистрировать связывание биомолекул с такой высокой чувствительностью гарантирует надежность получаемых результатов и высокое качество их интерпретации. В системе параллельно работают и одновременно могут быть задействованы 4 проточных канала измерений. Результаты, полученные от канала сравнения, могут автоматически вычитаться из результатов, получаемых в других каналах, что позволяет повысить разрешающую способность и информативность каждого анализа.

Технические усовершенствования управляемой проточной системы обеспечили возможность автоматической загрузки исследуемых образцов, точную автоматическую инъекцию проб, регулирование скорости потока от 1 до 100 мкл/мин., минимальные затраты ценных реактивов. Для проведения эксперимента и регистрации сигналов связывания во всех 4 каналах хватает лишь 1 мкл раствора. Малый объем проточного канала 0,02 мкл свел потери к минимуму. Специальное программное обеспечение позволяет автоматически проводить заданные процессы иммобилизации белков на поверхности металлической пленки, исследовать как отдельные образцы, так и осуществлять серии исследований с автоматической сменой растворов или/и образцов, выполнять детальную обработку результатов, вычислять все нужные пользователю показатели кинетики биохимических реакций. Имеется, например, и программа моделирования взаимодействий, которая позволяет еще до загрузки реальных образцов оптимизировать условия и последовательность проведения экспериментов с ними.

С помощью сенсора Biacore 3000 можно изучать как малые молекулы, начиная от молекулярной массы 180 а.е.м., так и большие клетки, бактерии, антитела, и находить ответы на такие, например, вопросы, как:

·              насколько специфическим является связь между молекулами (клетками) двух данных видов?

·              с какой скоростью происходит их связывание?

·              насколько сильной является их связь?

·              при каких условиях можно её разорвать?

·              как влияют температура, кислотность, концентрация, вид растворителя или третье вещество (фермент, катализатор, антитело) на ход реакций их связывания?

Поэтому эта система и подобные ей широко используются для исследований функций отдельных белков и других биохимических веществ, молекулярного распознавания, для исследований и анализов в областях иммунологии, онкологии, вирусологии, инфекционных заболеваний, биотехнологии и др.

На чувствительную поверхность ППР сенсора устанавливают специальную проточную ячейку, которая через патрубки присоединяется к системе регулирования потока исследуемой жидкости с использованием перистальтического насоса и инъекционного клапана. Поскольку проточная ячейка и патрубки очень тонкие (для экономии дорогостоящих препаратов), все жидкости должны быть профильтрованы сквозь 0,2 мкм фильтр и тщательно дегазированы. Вся проточная система должна регулярно промываться специальными растворами.

При биохимических исследованиях обычно проводят подготовительный цикл. В этом цикле через проточную ячейку прокачивается сначала раствор протеина, который оседает мономолекулярным слоем на поверхность золотой пленки. Потом прокачивают раствор тех биохимических молекул или антител, взаимодействие которых с молекулами или частицами аналита нужно изучить. Они присоединяются к протеину и образуют биорецепторный слой (лиганд). Эта процедура может длиться 1...2 ч. В цикле измерений проточная ячейка и чувствительная поверхность сначала промываются несколько минут буферным раствором. Потом через ячейку прокачивается заданный объем жидкости с исследуемым аналитом, и начинается измерение (фаза ІІ). Частицы аналита присоединяются к лиганду не сразу. Поэтому кривую ППР приходится измерять многократно, каждый раз рассчитывая по результатам измерений точное положение минимума ППР, и строить график его зависимости от времени. Этот график принято называть "сенсограммой". Всем этим автоматически руководит микропроцессор.

Как видим из рисунка 12, максимальная концентрация иммобилизованного (т.е. присоединенного к лиганду) аналита достигается лишь через несколько минут. Кинетика нарастания сдвига минимума ППР отображает кинетику химических реакций присоединения аналита к лиганду. Стационарное состояние, которое в конце концов устанавливается, является результатом динамического равновесия между химическими процессами присоединения и диссоциации (отсоединения) аналита и зависит как от констант соответствующих реакций, так и от концентрации аналита, температуры раствора, условий перемешивания и т.п. Это все можно исследовать.

В ходе следующей фазы (ІІІ) инжекция аналита прекращается, но продолжается прокачка чистой жидкости. Процессы присоединения практически прекращаются, идут лишь процессы диссоциации. Ход кривой на этой стадии позволяет вычислить константы этого процесса. А зная их, по результатам измерений в фазе ІІ можно вычислить и константы реакции присоединения. В фазе ІV через ячейку прокачивается раствор элюента, т.е. жидкости, которая, резко ослабляя химическую связь аналита с лигандом, постепенно "вымывает" аналит, практически не влияя на лиганд. И начинается регенерация биочувствительной поверхности, в ходе которой положение минимума ППР должно возвратиться к первоначальному. После этого можно начинать новый цикл измерений химического взаимодействия лиганда с другим или с тем же аналитом, но при других условиях. Практически удается провести свыше 50 разных исследований с одним и тем же лигандом.

Фирма Biacore AB выпускает и узко специализированные ППР сенсоры, как, например, BIACORE Quant, предназначенный специально для определения содержания витаминов.

Значительно более компактный интеллектуальный ППР сенсор SR7000 выпускает фирма Reichert Analytical Instruments, Inc. В нем используется расходящийся световой пучок и линейка фотодетекторов, которые обеспечивают наблюдение ППР в пределах углов отражения от 58,5 до 85 .

Для обеспечения равномерного распределения интенсивности исходящего светового пучка по углам применена т.н. "интегрирующая сфера". Оптическая призма выполнена из сапфира с показателем преломления 1,76. Чувствительный элемент на стеклянной подложке с показателем преломления 1,51 оптически соединен с призмой через тонкий слой иммерсионной жидкости.

Ученые и разработчики из лаборатории микроинструментов и систем университета в Майне (The University of Maine, показали, что размеры ППР сенсора совсем не обязательно должны быть большими, как в BIACORE 3000.

На основе 1 из кремния сформировано плоское миниатюрное зеркало 2, которое под действием электростатических сил может в пределах 10-20 вращаться вокруг оси, закрепленной на его приводе. В рабочем слое кремния сформированы также линейка фотодетекторов 3 с микросхемами усиления и селекции сигналов и микросхема управления приводом зеркала. Над кремнием сформирован слой стекла, в котором над зеркалом 2 и фотодетекторами вытравлена полость, заполненная прозрачной жидкостью 4. На поверхность стекла нанесена тонкая пленка из золота 5, необходимая для наблюдения ППР. Поверх пленки 5 формируется рецепторный слой 6, чувствительный к частицам аналита 7. К интегральному оптоэлектронному модулю подведено оптическое волокно 8, возле торца которого установлены коллимационная микролинза и микропризма 9. Через оптическое волокно 8 на модуль поступает монохроматический поляризованный свет. Микролинза формирует из него параллельный световой пучок, который отклоняется микропризмой на нужный угол и падает на зеркало 2. От зеркала свет попадает на чувствительную поверхность сенсора, а после отражения от нее - на линейку фотодетекторов 3.

Справа на рисунке 14 показан чувствительный блок ППР сенсора в собранном виде. Его размеры приблизительно 20x10x2 мм. Над чувствительной поверхностью интегрального модуля устанавливают проточную ячейку, через которую можно прокачивать растворы.

Для снятия кривой ППР микропроцессор включает источник поляризованного света. Свет по оптическому волокну 8 передается в интегральный модуль. С помощью микросхемы управления зеркалом 2 последнее устанавливается под заданным начальным углом. Микропроцессор считывает сигнал с фотодетектора, на который падает отраженный от чувствительной поверхности свет. Потом увеличивает на один шаг (например, на 0,05) угол наклона микрозеркала 2 и считывает из следующего фотодетектора интенсивность отраженного сигнала. После того как шаг за шагом будет снята вся кривая ППР, микропроцессор выключает источник света и вычисляет точное положение минимума ППР в данный момент времени. Через заданные интервалы времени измерения повторяются. Таким способом микропроцессор строит и выводит на экран сенсограмму процессов присоединения и диссоциации аналита, может вычислять параметры химической кинетики и концентрацию аналита в исследуемом растворе.

Большинство промышленных ППР сенсоров работает с угловой зависимостью интенсивности отраженных сигналов. Вариант наблюдения спектральной зависимости интенсивности отраженных сигналов длительное время не использовался, поскольку спектральные узлы с оптическими призмами или дифракционными решетками имели довольно значительные габариты. Но после того, как появились довольно компактные спектральные узлы типа Фурье-спектрометров и др., ситуация изменилась. И, например, американская фирма GWC Technologies выпустила в продажу ППР сенсор SPRimager II (рисунок 16), в котором используется инфракрасный Фурье-спектрометр. Резонансные кривые ППР наблюдаются в виде зависимости интенсивности отраженного света от волнового числа . Поскольку волновое число можно измерять с более высокой точностью, чем угол падения, то потенциально такой способ измерения является более чувствительным. Наилучшая разрешающая способность достигается в БИК свете с непрерывным спектром.

Сенсор спроектирован так, что в одной проточной ячейке может исследоваться одновременно целый массив разных проб. Образцы соответствующих "чипов" показаны на рисунке 16 справа вверху. В них на стеклянной основе сформированы островки диаметром 0,75-1 мм из тонкой пленки золота, на которую осажден мономолекулярный слой протеина. С помощью микропипетки на каждый островок можно нанести микрокаплю (0,3-0,5 мкл) соответствующего раствора и иммобилизовать из него на слой протеина свой лиганд. Это позволяет исследовать взаимодействие одного и того же аналита с разными лигандами в идентичных условиях. Сенсор позволяет также в любой момент времени получить изображение одновременно всех исследуемых островков в отраженном под заданным углом поляризованном инфракрасном свете, т.е. в условиях наблюдения ППР