Мы проанализировали вышеобозначенные карты генных взаимодействий при псориазе и пришли к выводу, что во всех исследуемых процессах в качестве основных транскрипционных факторов, изменивших свою экспрессию при псориазе, присутствуют только компоненты транскрипционного фактора АР-1 и транскрипционный фактор NF-kB. Фактор NF-kB, как известно, активируется при иммунных ответах и не является специфичным для псориаза, поэтому мы его исключили из генов-кандидатов.
Напротив, компоненты транскрипционного комплекса AP-1 могут являться генами-кандидатами при псориазе по следующим причинам. Известно, что транскрипционный фактор AP-1 представляет собой группу парных комплексов, образованных ДНК-связывающими белками, входящими в семейства Jun, Fos и ATF. Фактор AP-1 обеспечивает ответ клеток на действие ростовых факторов, цитокинов, нейротрансмиттеров и других межклеточных сигнальных молекул. В регуляции активности AP-1 участвуют G-белки, адаптерные белки, MAP-киназы и другие компоненты внутриклеточных регуляторных систем. Зависимые от AP-1 гены играют важную роль в регуляции пролиферации, морфогенеза, апоптоза и дифференцировки клеток. Транскрипционный фактор АР-1 участвует в поддержании базального уровня экспрессии многих генов. Он является одной из главных мишеней для соединений, вызывающих клеточную пролиферацию или дифференцировку.
Рисунок 8. Карта сетевых взаимодействий генов при передаче сигнала от EGF рецептора в клетку и изменение экспрессии генов, участвующих в данном пути, в пораженной коже, в сравнении с непораженной у больных псориазом.
Известно, что AP-1 обеспечивает ответ клеток на действие различных сигнальных молекул: цитокинов, пептидных гормонов, нейротрансмиттеров, ростовых и паракринных факторов. Активация AP-1 также происходит в экстремальных для клеток условиях: при тепловом шоке, гипоксии, в присутствии ксенобиотиков и токсинов, под действием УФ-облучения и ионизирующей радиации, а также при изменении осмотического давления и динамическом воздействии на плазматические мембраны.
Все это обусловливает возможность участия генов AP-1 системы в патогенезе воспалительных барьерных заболеваний. Действительно, при анализе данных экспрессионных микрочипов нами выявлено, что экспрессия генов c-Fos, c-Jun и JunB увеличена в 10-20 раз при псориазе.
5.5. Анализ уровней экспрессии генов, кодирующих компоненты транскрипционного фактора AP1
На основании биоинформационного анализа мы выдвинули предположение о возможной ключевой роли белков компонентов транскрипционного фактора AP1 в развитии поражения и сравнили экспрессию генов JUNB, JUND и ATF4 в пораженной псориазом коже по сравнению с непораженной.
Для анализа уровня экспрессии мы использовали метод полимеразной цепной реакции в реальном времени. Обработку результатов полимеразной цепной реакции проводили методом 2-ДДCT согласно [Livak and Schmittgen, 2001].
На рисунке 9 показано изменение уровня экспрессии генов JUNB, JUND и ATF4 в пораженной псориазом коже в сравнении с непораженной кожей этих же больных (№№1-4).
Видно, что экспрессия гена JUNB в пораженной коже увеличена по сравнению с непораженной в 2,5 раза (у больного №2) и до 7 раз (у больного №1). Экспрессия гена JUND увеличена у больных №1 и №3 в 2,5 и 4,5 раза, а гена ATF4 уменьшена в 1,5 и 5 раз, соответственно. У больного №2 экспрессия генов JUND и ATF4 практически не изменилась. Так же на рисунке 9 показано изменение уровня экспрессии генов JUNB, JUND и ATF4 в пораженной псориазом коже в сравнении с непораженной кожей у больного №4. У этого больного экспрессия всех изучаемых генов снижена (JUNB уменьшена в 1,3 раза, JUND в 2,6 раза, ATF4 в 1,7 раза).
Рисунок 9. Изменение уровня экспрессии генов JUNB, JUND и ATF4 у больных псориазом в пораженной коже по сравнению с непораженной.
5.6. Идентификация новых белков, участвующих в развитии очага поражения у больных псориазом
(на базе Института биомедицинской химии РАМН)
В данном исследовании мы использовали биопсии пораженной и непораженной кожи от трех пациентов больных псориазом Типа I.
После электрофореза и окрашивания гелей серебром мы идентифицировали 10 новых пятен, которые не встречались (или их интенсивность была существенно ниже) в непораженной коже и которые проявили себя в очаге поражения.
На рисунках 10 и 11 приведены электрофореграммы разделения белков в двух направлениях в пораженной и непораженной коже от одного пациента. Красной рамкой показаны пятна, которые изменены в пораженной коже по сравнению с непораженной.
Рисунок 10. 2D-электрофорез белков кожи, пораженной псориазом
Рисунок 11. 2D-электрофорез белков непораженной псориазом кожи
Пятна были вырезаны из геля (~ 3 мм2) и белки из них были идентифицированы. Белки из пятен № 1, 2, 3, 4 были идентифицированы методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, а белки из пятен 5-10 были идентифицированы методом nanoLC-MS/MS масс-спектрометрии.
Результаты идентификации белков приведены в таблице 3.
Таблица 3. Идентифицированные белки, различающиеся в пораженной и непораженной псориазом коже.
|
Пятно, номер |
Название белка |
%Vol |
||
|
Пораженная кожа |
Непораженная кожа |
|||
|
1 |
Кератин 17 |
1,97±0,92 |
0,18±0,06 |
|
|
Кератин 14 |
||||
|
Кератин 16 |
||||
|
2 |
SCCA2/SCCA1 |
0,28±0,09 |
0,066±0,02 |
|
|
3 |
Антиген чешуйчатой клеточной карциномы; SCC antigen |
0,35±0,18 |
0,03±0,01 |
|
|
4 |
Енолаза 1 |
0,87±0,22 |
0,40±0,14 |
|
|
5 |
Супероксиддисмутаза [Mn] |
0,22±0,03 |
0,11±0,02 |
|
|
6 |
Галлектин 7; Gal-7 |
1,14±0,41 |
0,19±0,01 |
|
|
7 |
Белок S100-A9 |
0,54±0,03 |
0 |
|
|
8 |
Белок S100-A9 |
0,15±0,07 |
0 |
|
|
9 |
Белок S100-A7 (Псориазин, Psoriasin) |
0,51±0,16 |
0 |
|
|
10 |
Белок S100-A7 (Псориазин, Psoriasin) |
1,36±0,37 |
0,02±0,03 |
Заключение
В этом разделе представлены полученные в работе результаты, а также приводятся новые литературные данные, свидетельствующие о возможных новых механизмах регуляции патогенетического процесса при псориазе.
ВЫВОДЫ
1. Проведенный биоинформационный анализ сетевых взаимодействий генов позволил отобрать гены, кодирующие белки- компоненты транскрипционного фактора АР-1, как возможные гены, влияющие на развитие патологического процесса при псориазе.
2. Показано, что в отличие от корреляции скорости ацетилирования с предрасположенностью к другому многофакторному заболеванию системной красной волчанке, нами не показана ассоциация между псориазом и скоростью ацетилирования. Тем не менее, полиморфное сочетание 282C/T 341C/C 481C/T 590G/A 803A/G 857A/A показало ассоциацию с заболеванием.
3. Определение соотношения транскриптов генов BAX/BCL2 до и после успешного лечения у больных псориазом дает основание считать, что это соотношение может быть маркером степени тяжести псориатического процесса.
4. Проведено количественное измерение экспрессии генов JUNB, JUND и ATF-4 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени, в результате чего было экспериментально показано изменение экспрессии данных генов в пораженной псориазом коже.
5. С помощью протеомного анализа образцов псориатической кожи установлены 10 маркерных белков, присутствующих только в пораженной коже. Данные белки могут рассматриваться как потенциальные мишени действия фармакологических препаратов при лечении псориаза.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. С.А. Брускин, М.К. Саркисова, Ан.Л. Пирузян. Метаболическая и генетическая паспортизация человека для ранней диагностики и индивидуальной фармакотерапии. Материалы Международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология». Минск. С. 219-221. 2004.
2. И.В. Голденкова, Ан.Л. Пирузян, М.К. Саркисова, С.А. Брускин, Р.М. Абдеев, А. Махулаева, И.М. Корсунская. Метаболическая и генетическая паспортизация человека для ранней диагностики и индивидуальной фармакотерапии кожных заболеваний на примере витилиго и псориаза, Материалы III Съезда генетиков и селекционеров России. «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Т.I. С. 63., Москва., 2004
3. С.А. Брускин, А.С. Глотов, Т.В. Наседкина, Л.А. Радкевич, И.В. Голденкова. Разработка микрочипа быстрого скрининга генотипа и установления фенотипа ацетилирования для метаболической и генетической паспортизации человека с целью ранней диагностики и индивидуальной фармакотерапии, IT+M&Ec'2005, С. 201-204. Гурзуф, Украина, 2005
4. Кожекбаева Ж.М., Глотов А.С., Брускин С.А., Голденкова И.В., Пирузян Э.С., Заседателев А.С., Наседкина Т.В. Разработка биочипа для определения аллельных вариантов NAT2 гена. VI Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток», С. 76, Звенигород, 2005
5. С.А. Брускин, А.В. Марахонов, И.В. Голденкова-Павлова, Э.С. Пирузян. Термостабильные ферменты для наработки новых терапевтических и профилактических препаратов и диагностических систем, Сборник научных трудов «Факторы экспериментальной эволюции организмов», С. 537-542., Алушта, 2006
6. И.М. Корсунская, Л.В. Егоренкова, Э.С. Пирузян, С.А. Брускин, Р.М. Абдеев, И.В. Голденкова-Павлова, Л.Т. Тогоева, С.С. Олейник, Ан.Л. Пирузян. Роль системы апоптоза в патогенезе псориаза. Клиническая дерматология и венерология. №6, C.13-17, 2006.
7. И.В. Голденкова-Павлова, С.А. Брускин, Р.М. Абдеев, Е.В. Маркарова, С. Г. Бигвава, Л.А. Радкевич, Х.А. Курданов, Ж.М. Кожекбаева, А.С. Глотов, О.А. Гра, А.С. Заседателев, Т.В. Наседкина, Э.С. Пирузян. Сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования у человека. Генетика. Т. 42. № 8. с. 1443-1450, 2006.
8. С.А. Брускин, Ж.М. Кожекбаева, Т.В. Наседкина, И.В. Голденкова-Павлова. Сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования у человека, Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире», С. 21, Москва, 2006
9. Z. M. Kozhekbaeva, O. A. Gra, A. S. Glotov, I. V. Goldenkova-Pavlova, S.A. Bruskin, E. V. Markarova, E. S. Piruzyan, T. V. Nasedkina. N-acetyltransferase 2 (NAT2) gene polymorphisms in psoriasis and colon cancer patients from the Moscow population// Supplementary of Eur. J. Hum. Genet. Nice. France, June 16-19. 2007 Ж. М. Кожекбаева, А. С. Глотов, О. А. Гра, И. В. Голденкова-Павлова, С. А. Брускин, Е. Е. Агафонова, Е. В. Маркарова, Р. М. Абдеев, И. М. Корсунская, Ан. Л. Пирузян, В. Е. Барский, А. С. Заседателев, Т. В. Наседкина. Определение точечных мутаций гена NAT2 с помощью биологических микрочипов// Молекулярная биология. №41, стр.725-733, 2007
10. Э.С.Пирузян, Т.А. Никольская, Р. М. Абдеев, С. А. Брускин. АР-1 система транскрипционных факторов как гены-кандидаты при псориазе// Молекулярная биология. т.41, C.1069-1080, 2007
11. Брускин С.А., Абдеев Р.М., Пирузян Э.С. Изучение изменения соотношения мРНК генов BAX/BCL-2 в коже больных псориазом. Приложение к журналу "Открытое образование" Материалы XV Международной конференции и дискуссионного научного клуба "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" IT+M&Ec'2007 Украина, Крым, Ялта-Гурзуф. С. 47-49, 2007
12. R.M. Abdeev, S.A. Brouskin, T.A. Nikolskaya, E.S. Piruzian. Survey of psoriasis candidate genes by using bioinfirmatics. In Abstract Book of Four International Symposium on Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources. Russia, Moscow, p. 71, 2007
13. S.A. Brouskin, R.M. Abdeev, T.A. Nikolskaya, E.S. Piruzian. Comparison of psoriasis and Crohn's disease pathological processes at the level of gene network interactions by bioinformatics methods. In Abstract Book of Four International Symposium on Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources. Russia, Moscow, p. 86, 2007