Автореферат: Поиск, идентификация и изучение экспрессии генов-кандидатов псориатического процесса

Брускин Сергей Александрович

ПоисК, идентификация и изучение экспрессии генов-кандидатов псориатического процесса

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2008

Работа выполнена в лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Доктор биологических наук, профессор Пирузян Элеонора Суреновна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, профессор Сулимова Галина Ефимовна

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН;

Доктор биологических наук, профессор Вейко Владимир Петрович ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится « » __________2008 г. в 14⁰⁰ часов на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Автореферат разослан «___» ___________ 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Заиграева Галина Григорьевна

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Псориаз - заболевание кожи, является сложной генетически обусловленной патологией, в проявлении которой задействованы большие группы (сети) взаимодействующих генов/белков. При этой патологии запуск патологического процесса происходит внешними триггерами окружающей среды (психоэмоциональные стрессы, инфекции и пр.). Патология на данный момент неизлечима, а лечение направлено на увеличение периодов ремиссии и на снижение тяжести болезни. В среднем псориазом страдает 3% населения мира, причем имеется четкая регионально-этническая дифференциация распространенности заболевания. Псориаз редко приводит к летальному исходу, однако существенно влияет на качество жизни пациентов и часто приводит к инвалидности. В последнее время псориазом болеет все больше молодежи, что впоследствии скажется на потере трудоспособности части взрослого населения, поэтому необходимо уже сейчас начинать разработку эффективных терапий и ранней диагностики псориаза.

Развитие любого многофакторного заболевания обусловлено двумя основными детерминантами - генетической предрасположенностью и запускающими заболевание триггерами. Локусы, связанные с псориазом, локализованы, по крайней мере, на 8 различных хромосомах и обозначаются как PSORS (Psoriasis Susceptibility) PSORS1 - PSORS9.

В патогенезе многофакторных заболеваний важным является вопрос, касающийся роли триггеров внешней среды. Некоторые из данных триггеров (например, инфекции) могут приводить к различному уровню экспрессии цитокинов у различных индивидуумов. Другие могут влиять на эпигенетические модификации (например, возможно опосредованные RUNX). Псориаз может быть спровоцирован стимулами внешней среды, такими как инфицирование стрептококком, повреждение (феномен Кебнера), стресс (нейропептиды), курение и алкоголь.

Характер питания и лекарственные препараты также могут провоцировать многофакторные заболевания. Среди токсинов N-нитросоединения являются основными кандидатами на роль триггеров многофакторных заболеваний. Поэтому является важным изучение полиморфизма генов системы биотрансформации ксенобиотиков.

Так как псориаз обусловлен разрегулированной работой генетического аппарата, то эффективным методом в разработке подходов для диагностики, лечения и создания лекарственных препаратов является поиск критических звеньев патологического процесса, а именно, генов-кандидатов и соответствующих белковых продуктов. Если генетические исследования многофакторных заболеваний продвинулись в достаточной степени как в России, так и за рубежом, то применение постгеномных технологий с целью выявления биомаркеров и исследования патогенеза данной патологии остаются задачей ближайшего будущего. К настоящему моменту, по существу, не опубликовано работ по комплексному использованию транскриптомики и протеомики для изучения псориаза. Благодаря стремительному развитию геномных и постгеномных технологий, пользуясь литературными источниками и базами данных, можно выделить известные ассоциированные с данными патологиями гены, на основании компьютерных исследований составить карты и сети, содержащие гены-кандидаты, и выделить подпроцессы, которые могут являться критическими в развитии патологий. Далее необходимо полученные результаты экспериментально проверить с помощью стандартных молекулярно-биологических методов.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования являлось проведение поиска, выявления и изучения экспрессии генов-кандидатов псориатического процесса.

В рамках работы были поставлены следующие задачи:

• Изучить возможную ассоциацию ферментов систем деградации ксенобиотиков у больных псориазом, на примере гена NAT2.

• Изучить изменение экспрессии генов BAX, BCL-2, CASP3 и TP53 при псориазе.

• С использованием методов информационной биологии определить круг генов-кандидатов патогенеза при псориазе.

• Проанализировать уровни экспрессии генов, кодирующих компоненты транскрипционного фактора AP1, в пораженной псориазом коже.

• Идентифицировать белки, участвующие в развитии очага поражения у больных псориазом.

Научная новизна работы. Впервые на основе анализа информационного материала при помощи программы «MetaCore®» компании GENEGO Inc. (США) определены гены-маркеры патологического процесса при псориазе, белки которых могут рассматриваться как потенциальные мишени для подбора индивидуализированной лекарственной терапии.

Впервые изучена возможная ассоциация полиморфизма гена системы биотрансформации ксенобиотиков (NAT2) и псориаза.

Впервые методом двумерного электрофореза проведено сравнение белковых профилей в пораженной и непораженной псориазом коже.

Практическая значимость работы. Данные, полученные при анализе экспрессии генов-кандидатов патогенеза при псориазе, могут способствовать разработке новых диагностикумов и идентификации новых мишеней лекарственных препаратов для лечения данного заболевания.

Апробация результатов работы. Основные положения и результаты работы были представлены на научно-практических конференциях «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2004); «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2005); «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004); на 4-ом съезде Европейской ассоциации дерматовенерологов в 2006г. в Финляндии; на межлабораторном семинаре Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (Москва, 2007); на межлабораторном семинаре Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва, 2007);

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на _153 страницах машинописного текста, включая _16_ таблиц, _41_ рисунок и __3_ фотографии. Список цитируемых литературных источников включает _137 наименований.

фермент ксенобиотик псориаз гены

Основное содержание работы

Глава 1. Псориаз: характеристика заболевания и генетика патологии

В данной главе приведена клиническая характеристика заболевания и эпидемиология псориаза, обсуждается характер наследования заболевания. Особое внимание уделяется вопросу о роли триггеров внешней среды в патогенезе данного заболевания. В главе рассматриваются локусы, связанные с псориазом, локализованные, по крайней мере, на восьми хромосомах человека. Глава завершается обсуждением рабочей модели иммунопатогенеза псориаза. Особое внимание уделено процессам, происходящим в коже человека при развитии псориаза - в бессимптомной коже (предпсориатическая или визуально непораженная кожа больного), в которой уже возник ряд молекулярных изменений, и при появлении хронических поражений (псориатических бляшек).

Глава 2. N-ацетилтрансферазы человека

В главе обсуждается фенотип ацетилирования у человека и полиморфизм гена NAT2. Приведен список аллелей NAT2 у человека. Обсуждается ассоциация фенотипа ацетилирования с рядом многофакторных заболеваний, в числе которых ряд онкологических заболеваний, астма, диабет 1 типа, системная красная волчанка.

Глава 3. Транскрипционный фактор АР-1

В главе обсуждаются компоненты транскрипционного фактора AP-1, участие их в ответе клеток на действие ряда сигнальных молекул, их участие в процессах развития кожи, а также механизмы регуляции экспрессии генов, кодирующих компоненты транскрипционного фактора AP-1.

Глава 4. Материалы и методы

В главе приведен перечень бактериальных штаммов и сред для выращивания E.coli, составы использованных буферов.

Приведены методы выделения ДНК и РНК, определения фенотипа ацетилирования, генотипа ацетилирования на микрочипах, мультиплексной полимеразной цепной реакции, обратной транскрипции, полуколичественной полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Приведены методы определения активности каспазы-3 в образцах кожи колориметрическим методом, определения содержания белка р53 в образцах кожи методом Вестерн-блот гибридизации. Приведен метод двумерного электрофореза.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы STATISTICA 6.0.

Глава 5. Результаты и обсуждение

5.1 Сравнительное изучение фенотипа ацетилирования и полиморфизма гена NAT2

Для того чтобы провести сравнительный анализ результатов по полиморфизму N-ацетилирования, получаемых с использованием метода определения ацетилирующей способности индивидуума (фенотип ацетилирования) и метода аллель-специфичной гибридизации на микрочипе (генотип ацетилирования), были проведены следующие исследования.

Фенотип ацетилирования был определен в группе волонтеров методом тестирования скорости ацетилирования сульфадимезина. Генотип NAT2 в популяционной выборке волонтеров определяли методом гибридизации ДНК на биочипе и на основании полученных результатов рассчитывали предполагаемые фенотипы ацетилирования. Как видно из представленных данных, частота медленных ацетиляторов в популяционной выборке составляет 45% (рисунок 1) и достоверно не отличается (p>0.01) от результатов, полученных при определении фенотипа ацетилирования методом тестирования скорости ацетилирования (47%).

Рисунок 1. Частота фенотипов быстрых и медленных ацетиляторов по локусу NAT2 в московской выборке волонтеров, рассчитаная согласно данным фенотипирования и генотипирования

Сравнительные характеристики и предполагаемые области применения двух подходов (количественное определение скорости ацетилирования и качественное определение генотипа ацетилирования) для определения статуса ацетилирования у индивидуумов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Сравнительные характеристики и области применения методов определения фенотипа и генотипа ацетилирования