Автореферат: Поиск, идентификация и изучение экспрессии генов-кандидатов псориатического процесса

На основании полученных данных и сравнительного анализа можно сделать следующие заключения. Метод определения ацетилирующей способности индивидуума для выявления фенотипа ацетилирования за одно измерение позволяет суммировать все известные полиморфизмы и количественно определить уровень ацетилирования у индивидуума. На основании этого можно предложить этот метод для количественной оценки скорости ацетилирования у индивидуума и более точного предсказания риска токсичности или, наоборот, положительного эффекта от применения лекарственных препаратов. Метод гибридизации ДНК на олигонуклеотидной матрице (биочипе) позволяет достаточно точно определить генотипы и аллели, а также распределение частот аллелей и генотипов в популяционных выборках индивидуумов. На основании этого можно предположить, что созданный гелевый микрочип даст возможность проводить популяционные исследования по генетическому полиморфизму ацетилирования индивидуумов без фенотипирования, в том числе и с целью установления корреляции между генотипом ацетилирования и предрасположенностью данного индивидуума к заболеваниям.

5.2. Полиморфизм гена NAT2 и его ассоциация с псориазом

На основании литературных данных, свидетельствующих о том, что полиморфизм гена NAT2 строго ассоциируется с рядом онкологических заболеваний, а также в связи с имеющимися литературными данными о взаимосвязи фенотипа ацетилирования с другим системным воспалительным аутоиммунным барьерным заболеванием - системной красной волчанкой (SLE), нами было высказано предположение о возможной взаимосвязи фенотипа ацетилирования и псориаза.

Основываясь на результатах по взаимосвязи между фенотипом и генотипом ацетилирования и на возможности использования биологических микрочипов для определения генотипа NAT2, нами было проведено исследование группы больных псориазом (180 человек) и здоровых волонтеров (99 человек).

В таблице 2 показано распределение частоты встречаемости шести однонуклеотидных замен в позициях 282, 341, 481, 590, 803 и 857 гена NAT2 у больных псориазом и здоровых индивидуумов. Это основные, наиболее часто встречающиеся замены в московской выборке, вносящие вклад в изменение фенотипа ацетилирования. Частота встречаемости ни одной из замен достоверно не различаются (p>0.01) в выборке здоровых волонтеров и больных псориазом. Это указывает на отсутствие роли ряда ксенобиотиков, а также продуктов их биотрансформации за счет ацетилирования N-ацетилтрансферазой, в запуске или развитии патогенеза псориаза.

Также не выявлено достоверного отличия (p>0.01) между скоростью ацетилирования у больных псориазом и здоровых индивидуумов.

Таблица 2. Сравнение распределения частот встречаемости однонуклеотидных замен в позициях 282, 341, 481, 590, 803 и 857 гена NAT2 у больных псориазом (слева) и здоровых индивидуумов (справа) в г. Москве

A - аллель дикого типа, а - аллель мутантного типа

Следует, однако, подчеркнуть, что у больных псориазом выявлена достоверная ассоциация (p<0.01) с полиморфным сочетанием 282C/T 341C/C 481C/T 590G/A 803A/G 857A/A в гене NAT2.

5.3 Изменение некоторых апоптических медиаторов и эффекторов в коже у больных псориазом

В нормальном эпидермисе кератиноциты поддерживают точное и тонко сбалансированное соотношение между клеточной пролиферацией и клеточной дифференцировкой. При созревании кератиноцитов в псориатических бляшках нарушены клеточная дифференциация и клеточная пролиферация. Если нормальный цикл созревания кератиноцитов составляет 28-30 дней, то при псориазе наблюдается его ускорение в восемь раз и сокращение цикла созревания кератиноцитов до 3-4 дней [Bowcock, Cookson, 2004]. Кроме того, в псориатической коже отмечаются изменения в процессе апоптоза, что приводит к утолщению рогового слоя кожи.

Нами было изучено изменение соотношения продуктов генов BAX и BCL-2 в пораженной и непораженной коже больных псориазом и его изменение после лечения методом полуколичественной ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией. Лечение пациентов проводилось препаратом Глутоксим®. Эффективность лечения оценивалась по изменению индекса PASI.

На рисунке 2 показано влияние успешного лечения препаратом «Глутоксим®» на соотношение мРНК генов Bax/Bcl-2. Соотношение Bax/Bcl-2 изменилось достоверно (p<0.01).

Рисунок 2. Изменение соотношения мРНК генов в коже больных псориазом до и после лечения препаратом «Глутоксим®».

Независимо от пути развития сигнала на апоптоз ключевая роль в процессе отводится каспазам, ферментам, осуществляющим деградацию белков и нуклеиновых кислот в клетке. Вследствие того, что каспаза-3 является, если не ключевой, то одной из самых важных эффекторных каспаз, мы определяли изменение ее активности в пораженной коже больных псориазом, а также изучили влияние лечения пациентов на изменение активности каспазы в коже больного.

Однако здесь мы не получили достоверного отличия активности фермента (рисунок 3) в группе больных до и после лечения (p>0.01).

Рисунок 3. Изменение активности белка каспазы-3 в коже больных псориазом до и после лечения препаратом «Глутоксим®».

5.4 Компоненты транскрипционного фактора AP-1 как гены - кандидаты при псориазе.

Нашей задачей было произвести поиск генов-кандидатов на развитие псориатического процесса. Классический генетический подход в поиске генов-кандидатов заключается в семейном анализе и установлении генетических ассоциаций между проявлением болезни и сцепленными с этим проявлением локусами. На данный момент высокоинформативным инструментом изучения экспрессии больших групп генов являются результаты экспериментов, в которых экспрессия генов оценивается количественно с помощью биологических микрочипов. В своих биоинформационных исследованиях мы использовали базу данных GEO DataSets (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), в которой в виде электронных таблиц собраны результаты экспериментов оценки уровня экспрессии генов на микрочипах. Для дальнейшего анализа нами была отобрана запись GDS1391, в которой представлена информация об уровне экспрессии генов в коже трех здоровых волонтеров, а также в пораженной и непораженной коже четырех больных псориазом.

На данный момент в рамках стремительного развития постгеномных технологий появляются программные продукты, позволяющие концентрировать и систематизировать большие объемы генетической информации, выстраивать гипотезы генных сетевых взаимодействий. Одной из таких программ является программный продукт MetaCore® компании GENEGO Inc (США). В результате информационного анализа экспрессии около 12000 генов на биологических микрочипах с помощью программы MetaCore нами было установлено, что число генов, изменивших свою экспрессию более чем в 1,5 раза при псориазе, составляет 7563.

На первом этапе мы сравнили уровни экспрессии генов (транскриптом) в пораженной коже больных псориазом и в коже здоровых волонтеров. Для всех генов был установлен порог изменения уровней экспрессии равный 2, то есть программа будет работать только с теми генами, уровень экспрессии которых изменен (увеличен или уменьшен) более чем в 2 раза в пораженной коже, по сравнению с уровнем экспрессии тех же генов в коже здоровых волонтеров.

Анализ транскриптомных данных показал, что при псориазе преимущественно наблюдается увеличение транскрипции множества генов. Обилие генов, существенно увеличивших свою экспрессию при псориазе в ключевых процессах клеточного метаболизма, свидетельствует в пользу того, что патологический процесс в пораженной коже в целом обусловлен именно увеличением транскрипционной активности генов в клетках кожи, что совпадает с литературными данными о гиперактивности пролиферативной способности кератиноцитов кожи и ускоренных процессах дифференцировки клеток кожи [Liu Y et al., 2007].

Если представить распределение генов, изменивших свою транскрипцию в пораженной коже больных псориазом по сравнению с кожей здоровых волонтеров, по их участию в различных молекулярно-генетических процессах, то основными измененными процессами в коже при псориазе являются иммунный ответ, клеточный цикл, воспаление, пролиферация и др. (рисунок 4).

Рисунок 4. Основные процессы, измененные в коже больных псориазом, по сравнению с кожей здоровых волонтеров

Большой интерес для нас представляло сравнение уровней экспрессии генов в пораженной части кожи больных псориазом по отношению к визуально непораженной части кожи, находящейся на расстоянии не более 3 см от пораженной псориазом кожи одного и того же больного. Такое сравнение позволяет максимально исключить влияние побочных факторов на чистоту эксперимента. Для всех генов был установлен порог изменения уровней экспрессии равный 2. Мы сравнивали данные от 4-х пациентов.

На рисунке 5 показаны первые 20 наиболее измененных процессов в пораженной коже больных в сравнении с непораженной кожей. Как видно, этими процессами являются развитие эпидермиса, кератинизация, дифференциация кератиноцитов, метаболизм липидов и другие.

Рисунок 5. Первые 20 наиболее измененных процессов в пораженной коже в сравнении с непораженной кожей больных псориазом.

Далее мы выдвинули гипотезу, что для изменения экспрессии больших групп координировано работающих генов, что мы можем наблюдать при псориазе, задействованных в тех или иных процессах в клетке (множество разрегулированных процессов при псориазе), необходимо, чтобы, прежде всего, изменили свою экспрессию ключевые транскрипционные факторы, инициирующие каскадные процессы.

Нами проанализированы измененные при псориазе клеточные процессы с целью их детального описания. При этом для дальнейшего анализа мы выбрали 10 процессов с самым высоким значением величины p-value. Для визуализации генетических процессов на уровне генных сетевых взаимодействий мы использовали карты сетевых взаимодействий генов, наложив на них изменения в уровнях экспрессии генов. При этом выбирали карты взаимодействий генов, описывающие основные измененные процессы в клетке. Карты сетевых взаимодействий генов отличаются от генных сетей тем, что в них информация о генных взаимодействиях систематизирована и выстроена в соответствии с современными представлениями о конкретном молекулярно-генетическом процессе, описанном с помощью данной карты. На рисунке 6 приведены условные обозначения, используемые на картах сетевых взаимодействий генов.

Рисунок 6. Условные обозначения, используемые на картах сетевых взаимодействий генов.

На рисунке 7 приведена карта сетевых взаимодействий генов при передаче сигнала от EGF рецептора в клетку и изменение экспрессии ее компонентов в пораженной коже больных псориазом по сравнению с кожей здоровых волонтеров. Видно, что, хотя уровень экспрессии рецептора не изменен значительно, существенно изменен уровень экспрессии всех его лигандов (от 2 раз для EGF до более чем в 30 раз для ERBB2). Также обращает на себя внимание и то, что изменена экспрессия генов, которые активируются различными путями после связывания рецептора с лигандом.

Рисунок 7. Карта сетевых взаимодействий генов при передаче сигнала от EGF рецептора в клетку и изменение экспрессии генов, участвующих в данном пути, в пораженной коже, в сравнении с кожей здоровых волонтеров.

На рисунке 8 показано сетевое взаимодействие генов при передаче сигнала от EGF рецептора (EGFR) в клетку и изменение экспрессии генов, участвующих в данном пути, в пораженной коже, в сравнении с непораженной. Как видно, в пораженной коже значительно изменена экспрессия только транскрипционных факторов (c-Fos, c-Myc и STAT3, примерно в 2,5-3 раза). Если сравнить данные, представленные на рисунке 8, с данными, представленными на рисунке 7, то мы увидим, что ни медиаторы передачи сигнала, такие как GRB2, Shc, SOS, h-Ras, c-RAF, MEK1/2 и др., ни лиганды, ни рецептор не изменили свою экспрессию, а активированными в пораженной коже в сравнении с непораженной остались только c-Fos, c-Myc и STAT3. Однако необходимо отметить, что, если в сравнении со здоровыми, c-Myc и c-Jun увеличивали экспрессию почти в 7 раз, то в сравнении с непораженной кожей c-Jun не изменил экспрессию, а c-Myc увеличил всего в 3 раза, c-Fos и STAT3 увеличивали экспрессию в 13 и 11 раз, соответственно, в сравнении со здоровыми и всего в 2,7-3 раза в сравнении с непораженной кожей. Все это свидетельствует в пользу того, что изменения процессов метаболизма происходят не только в пораженной, но и в непораженной коже, причем непораженная кожа больных псориазом, в смысле измененных метаболических процессов, занимает промежуточное положение между кожей здоровых людей и пораженной кожей [Nickoloff and Nestle, 2004].