Материал: Оценка правильности определения суммарного содержания антиоксидантов в пищевых продуктах методом Frap с потенциометрическим детектированием

FRAP (ferric reducing antioxidant power): метод основан на следующей реакции:

Fe(III)-Трипиридитриазин+АО→Fe(II)-Трипиридилтриазин.

Железовосстанавливающая/антиоксидантная способность (FRAP)[20]. Здесь используется реакция восстановления Fe(III)-трипиридилтриазина до Fe(II)-трипиридилтриазина [21]. Однако этим методом невозможно определение некоторых антиоксидантов, например глутатиона. Этот метод позволяет прямое определение низкомолекулярных антиоксидантов. При низких рН восстановление Fe(III)-трипиридилтриазинового комплекса в Fe(II)-комплекс сопровождается появлением интенсивно голубой окраски. Измерения основаны на способности антиоксидантов подавлять окислительный эффект реакционных частиц, генерируемых в реакционной смеси. Этот метод отличается простотой, быстротой и небольшими затратами при исполнении.

ORAC (oxygen radical absorbance capacity): метод основан на следующей реакции:

(II)+H₂O₂→Fe(III) + OH*+AO→OH* + Люминол.

Определение способности абсорбировать кислородные радикалы (ORAC). В этом методе регистрируют флуоресценцию субстрата (фикоэритрина или флуоресцеина), которая возникает в результате его взаимодействия с АФК. Если в исследуемом образце есть антиоксиданты, то наблюдают уменьшение флуоресценции по сравнению с контрольным образцом [23]. Первоначально этот метод был разработан доктором Гохуа Као в Национальном институте старения в 1992 г. В 1996 году доктор Као объединился с доктором Рональдом Прайером в совместную группу в Исследовательском центре старения USDA, где был создан полуавтоматический метод [24].

4 TRAP (total radical trapping antioxidant parameter) [25]: метод основан на следующей реакции:

+AO→AAPH* + ФЛ (ФЭ).

В этом методе используют способность антиоксидантов взаимодействовать с пероксильным радикалом 2,2’- азобис(2-амидинопропан) дигидрохлорид (ААРН). Модификации TRAP состоят в способах регистрации аналитического сигнала. Чаще всего на завершающей стадии анализа перокси-радикал ААРН взаимодействует с люминисцирующим (люминол), флуоресцирующим (дихлорфлюоресцин-диацетат, DCFH-DA) или другим оптически активным субстратом.

В качестве стандарта для методов TEAC, ORAC и TRAP используют водорастворимое производное витамина Е - Trolox (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбокси кислоту).

В последнее время для оценки антиоксидантной активности возрос интерес к применению электрохимических методов. Эти методы обладают высокой чувствительностью, быстротой анализа.

Оценку антиоксидантной активности некоторых пищевых продуктов проводят методом потенциометрии, основанном на использование свойства веществ-антиоксидантов участвовать в окислительно-восстановительных реакциях за счет енольных (-ОН) и сульфгидрильных (-SH) групп.

Определение антиоксидантных свойств растворов основано на химическом взаимодействии антиоксидантов с медиаторной системой, которое приводит к изменению ее окислительно-восстановительного потенциала. Электрохимическая ячейка представляет собой емкость, содержащую K-Na-фостфатный буферный раствор, медиаторную систему Fe(III)/Fe(II) и комплексный электрод до измерения окислительно-восстановительного потенциала. Антиоксидантную активность оценивают в г-экв/л.

Амперометрический метод определения антиоксидантной активности основан на измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества на поверхности рабочего электрода, находящегося под определенным потенциалом. Чувствительность амперометрического способа определяется как природой рабочего электрода, так и потенциалом, приложенном к нему. Предел обнаружения амперометрического детектора полифенолов, флавоноидов на уровне нано-пикограммов,при таких малых концентрациях меньшая вероятность взаимного влияния разных антиоксидантов при их совместном присутствии, в частности проявление явления синергизма. К недостаткам способа можно отнести его специфичность: в данных условиях не могут быть проанализированы антиоксиданты, которые сами окисляются или восстанавливаются в области потенциалов электровосстановления кислорода. К достоинствам способа можно отнести его экспрессность, простату и чувствительность [26].

Метод гальваностатической кулонометрии с помощью электрогенерированных окислителей - метод применим для анализа жирорастворимых антиоксидантов [27].

Разработаны различные способы определения аскорбиновой кислоты:

- амперометрический способ с использованием алюминиевого электрода, модифицированного пленкой гексацианоферрата никеля (II), методом простого погружения в раствор;

- способ твердофазно-спектрофотометрического и визуального тест-определения аскорбиновой кислоты с использованием в качестве индикаторного порошка ксерогеля кремниевой кислоты, модифицированного реактивом Вавеле и медью (II);

- хемилюминесцентное определение аскорбиновой кислоты можно провести проточно-инжекционным методом по хемилюминесцентной реакции родамина В с церием (IV) в сернокислой среде [10].

- определение аскорбиновой кислоты в диапазоне 10^-8-10^-3 г/см³ методом анодной вольтамперометрии в водных и водно-органических средах.

Наиболее распространенным является метод FRAP, так как он экспрессен, высокочувствителен. За последние несколько десятилетий было разработано большое количество разновидностей методик определения антиоксидантной активности методом FRAP(таблица 1).

Таблица 1 - Развитие метода FRAP и его применение для определения антиоксидантной активности разных объектов[30]

Авторы и ссылка	Год	Реагент	Хст	Объекты анализа	Примечания
Benzie, Strain	1996	TPTZ	Fe(II)	Плазма крови	t=4мин. Изучены стехиометрия реакции и аддитивность.
Benzie, Strain	1999	TPTZ	Fe(II),АК	Чай, вино	Определение АОА, обусловленной полифенолами
Benzie, Szeto	1999	TPTZ	Fe(II)	Чай	Сопоставлены значения АОА разных сортов чая
Pulido,Bravo,Saura-Calixto	2000	TPTZ	Fe(II)	Модель-ные растворы	t=30мин. Выявлено влияние неводного растворителя
Arya,Jain, Mahajan	2002	DPA	АК	Растения
Kleszczwsky, Kleszczwska	2002	DIP	АК	Кровь, ткани	Метод ПИА. Проверено влияние посторонних веществ.
Firuzi,Lacanna, Petrucci e.a.	2004	TPTZ	Fe(II)	Модель-ные растворы	Изучена чувствительность определения разных АО как функция их структуры и редокс-потенциала.
Katalinic, Milos, Modun e.a.	2004	TPTZ	КТ	Разные вина
Темердашев, Цюпко и др.	2006	DIP, PHEN	АК	Модель-ные смеси	t=60мин
Логинова, Коновалова	2007	DIP	-	Лекарств. Препара-ты	Тест-метод
Темердашев, Цюпко и др.	2008	PHEN	АК	Красные сухие вина	Корреляция АОА с другими показателями качества вин
Продолжение таблицы 1
Berker, Guclu, Demirata,Apak	2010	FZ	Fe(II)	Модель-ные смеси	Изучена чувствительность определения разных АО
Вершинин, Власова, Цюпко	2010	DIP, PHEN	АК	Модель-ные смеси	Выявлена неаддитивность сигнала при недостатке окислителя
Анисимович, Дейнека и др.	2010	DIP	Fe(II)	Модель-ные растворы	Предложены кинетические параметры оценки АОА.

Примечания: условно обозначено: ПИА-проточно-инжекционный анализ, TPTZ-трипиридилтриазин, DIP-2,2^,-дипиридил, PHEN-о-фенантролин, DPA-пиридиндикарбоновая кислота, FZ-феррозин, АК-аскорбиновая кислота, КТ-катехол, t-время экспозиции, мин.

.5 Антиоксидантные свойства некоторых пищевых продуктов

В настоящее время антиоксидантные свойства выявлены у многих пищевых продуктов. Примерами таких продуктов являются:

- цитрусовые плоды;

- различные сорта яблок;

- стевия и продукты ее переработки;

- различные сорта хлеба;

- зерна ячменя, овса, сорго, риса и продуктов их переработки;

- чай;

- кофе;

- различные сорта вин и т.д.

Антиоксидантные свойства цитрусовых плодов. Самыми известными и широко употребляемыми в 20-м веке были синтетические антиоксиданты. Однако в последнее время они стали уступать место природным антиоксидантам. Все большее внимание исследователей привлекают антиоксиданты, содержащиеся в пищевых системах. Одной из таких систем, проявляющей свойства АО, являются цитрусовые плоды, благодаря наличию в их составе ряда специфических компонентов.

Вещества, обладающие наибольшей антиоксидантной активностью в апельсиновых соках: гиспередин, нарирутин, пентаметоксифлавон, гексаметоксифлавон, нарингин, бензойная кислота. Рутин и кверцетин оказывают существенное ингибирующее действие в процессе окисления липопротеинов низкой плотности, тем самым снижая риск возникновения атеросклероза.

Противоокислительная способность цитрусовых плодов связана с наличием аскорбиновой кислоты. Пастеризация при нагревании увеличивает скорость разложения аскорбиновой кислоты,а следовательно возрастает потеря противоокислительной активности. Наивысшей активностью против радикалов, как и наивысшим содержанием веществ за нее ответственных - антоцианов, аскорбиновой, синаповой, кофейной, ферруловой, кумариновой кислот, обладают свежеотжатые апельсиновые соки. Концентрирование и пастеризация соков значительно снижают количество полезных веществ, и уменьшает антиоксидантную активность в 1,5-2 раза. Не только сам апельсиновый сок является источником антиоксидантных веществ, но и продукты переработки апельсинов также могут проявлять антиоксидантные свойства [31].

Антиоксидантные свойства различных сортов яблок. Исследования показали, что сок летних сортов яблок Мальт и Монтен имеет более высокие показатели FRAP, чем сок трех осенних сортов яблок. Мезга яблок проявляет большую АОА, чем сок. Концентрат из сока осенних сортов яблок, согласно результатам испытаний по методу FRAP, является лучшим антиоксидантом, чем из сока летних сортов яблок. Определение хелирующей активности также широко используется для исследования антиоксидантных характеристик пищевых систем.

Среди всех металлов железо играет важнейшую роль в процессе липидного окисления благодаря своей высокой активности. Бивалентный переход ионов металлов катализирует окислительные процессы, так как приводит к образованию гидроксильных радикалов. Мезга яблок, как и при определении АОА по методу FRAP, обладает более высокой хелирующей активностью, чем сок. Однако яблочный концентрат из соков летних сортов яблок, согласно методу FIC, более активен, чем из сока осенних сортов яблок.

Для яблок и яблочных концентратов значения АОА, определенные по методу FRAP,превышают в 2-5 раз показатели FRAP для красных вин, в 4-10 раз - для растительных масел и находятся на уровне показателей для лекарственных растений [32].

Антиоксидантные свойства зерна ячменя, овса, сорго, риса и продуктов их переработки. Зерновые отруби намного богаче антиоксидантами, чем само зерно и его эндосперм, отруби содержат в основном два класса антиоксидантных веществ: антоцианы и фенольные кислоты, их содержание значительно уменьшается при тепловом воздействии на зерно. Содержание антиоксидантов во многом зависит от генотипа и сорта растения, а также условий его выращивания.

При изучении влияния химического состава и антиоксидантной активности на способность улавливать свободные радикалы и восстанавливать ферроцианид для 10 сортов ячменя и полученного из него солода установлено, что общее содержание фенольных веществ и восстанавливающая сила выше для солода, содержание флаван-3-олов-для ячменя. Способность улавливать свободные радикалы определяются сортом ячменя.

Не только сам ячмень, но и продукты его переработки-ячменная шелуха может использоваться в качестве источника антиоксидантных веществ. Шелушение уменьшает способности 2,2^,-дифенил-1-пикрилгидразила связывать свободные радикалы. Наиболее эффективный продукт из овсяных отрубей по антиоксидантному индексу был получен при обработки микроволновым облучением при температуре 150 градусов.

Добавление ячменной муки в хлеб повышает его антиоксидантную способность. При выпечке количество свободных фенолов снижается, а связанных - увеличивается.

Антирадикальные активности сорго более эффективны, чем пшеница или ячмень. Отруби сорго богаче антиокислительными веществами, чем зерно; наибольшей активность обладало сорго урожая 1999 г.

Зерна ячменя обладают наибольшим количеством минеральных веществ. Но наивысшими показателями по общему содержанию фенольных веществ и антиоксидантной активности обладает зерно сорго. В порядке убывания антирадикальной активности зерновые культуры расположились следующим образом: сорго>просо>рожь>ячмень>твердая пшеница>мягкая пшеница. Зерна малого и большого размера по исследованным показателям почти не различаются, черные сорта риса более сильные антиокислители, чем белые.

За последние годы были проведены работы по введению различных сортов зерна в состав хлебобулочных и кондитерских изделий.

Тепловая обработка существенно снижает все антиокислительные показатели. Экологические факторы изменяют антиоксидантную активность отрубей в различной степени. Наивысшая антиокислительная активность наблюдается для мелких фракций отрубей [33].

1.6 Оценка показателей прецизионности (повторяемости и воспроизводимости) и точности методики анализа

 

Основные допущения в рамках принятой модели и общие требования к проведению эксперимента:

Распределение случайной погрешности результата анализа (единичного анализа) принимают нормальным.

Распределение неисключенной систематической погрешности методики анализа принимают нормальным.

Влияющие факторы пробы не оказывают значимого влияния на погрешность результатов анализа.

Образцы для оценивания (ОО) выбирают таким образом, чтобы содержание определяемого компонента ОО позволили охватить диапазон измерений, предусмотренный методикой.

Общий состав ОО соответствует области применения методики. В общем случае число ОО не менее пяти.

ОО стабильны во время проведения эксперимента. В противном случае нестабильность ОО учитывается при расчете показателя прецизионности

ОО выбирают таким образом, чтобы погрешность, связанная с изменением содержания компонента в навесках этого ОО, была пренебрежимо мала по сравнению с показателем повторяемости методике анализа, в противном случае она будет одним из факторов, влияющим, формирующих прецизионность анализа.

Планирование эксперимента отвечает условиям воспроизводимости. С этой целью ОО отсылают в L лаборатории, каждая из которых получает N результатов единичного анализа в условиях повторяемости. Выбор количества лабораторий и количества результатов единичного анализа каждого ОО осуществляют в соответствии с РМГ 61-2003 [34]. При выборе количества лабораторий и единичного анализа учитывают погрешность оценки среднего квадратичного отклонения воспроизводимости.

Применение - В соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2 [35] под "лабораторией" понимают сочетание факторов, как "оператор", "оборудование" и "место измерений". Одна лаборатория в общепринятом значении этого слова представляет собой несколько "лабораторий" в том случае, если она может предусматривать наличие нескольких операторов, каждый из которых располагает своим рабочим местом с комплектом оборудования и условиями, в которых выполняют работу.

С учетом РМГ 61-2003 получение результатов единичного анализа организовывают с соблюдением следующих требований:

Средства измерений, указанные в документе на методику анализа, поверены (калиброваны).

Каждая группа из N результатов единичного анализа получена при соблюдении условий повторяемости, т.е. в пределах короткого интервала времени и одним и тем же оператором с использованием одной и той же мерной посуды, одних и тех же реактивов. Средств измерений.

Группа из N результатов единичного анализа разных ОО в одной лаборатории могут быть получены и в разные дни, но обязательно одним оператором. Если один оператор не может выполнить полностью анализы всех ОО, его заменяют другим оператором при анализе другого ОО. При этом N результатов единичного анализа одного ОО получает один оператор.

В каждой лаборатории должен быть назначен ответственный за организацию фактического выполнения эксперимента.

Для оценки показателя повторяемости методики анализа рассчитывают среднее арифметическое  и выборочную дисперсию  результатов единичного анализа содержаний компонента в m-ном ОО, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений):

 

_, (1)

где i=1, N;

l=1, L;

x_il- результат измерения;

N-количество измерений.

 , (2)

где - выборочная дисперсия результатов единичного анализа;

- среднее арифметическое.

На основе полученных значений выборочных дисперсий в m-ном ОО проверяют гипотезу о равенстве генеральных дисперсий, используя критерий Кохрена.

Величина G_max рассчитывают по формуле и сравнивают с G_табл для числа степеней свободы , соответствующего числу суммируемых дисперсий, и принятой доверительной вероятности P = 0,95.

где ∑-сумма выборочных дисперсий единичного анализа;

_max-максимальное значение выборочных дисперсий единичного анализа. 

Если G_max > G_табл, то соответствующее  из дальнейших расчетов исключают и процедуру повторяют до следующего по величине  и т. д. до тех пор, пока G_max не станет меньше, либо равно G_табл.

Неисключенные из расчетов  считают однородными и по ним оценивают среднеквадратичное отклонение (СКО), характеризующие повторяемость результата единичного анализа (параллельных определений), полученных для содержания, соответствующего содержанию компонента в m-ном ОО. Показатель повторяемости методики анализа в виде среднего квадратичного отклонения рассчитывают по формуле:

, (4)

где ∑-сумма выборочных дисперсий единичного анализа;

L-количество повторений измерений.

Показатель повторяемости методике анализа в виде предела повторяемости r для содержания, соответствующего содержанию компонента в m-ном ОО, рассчитывают по формуле:

=Q (P, n), (5)

где n-число параллельных определений, предусмотренных методикой для получения результата анализа,

Q (P, n) =2,77 при n=2, P=0,95

Q (P, n) =3,31 при n=3, P=0,95

Q (P, n) =3,63 при n=4, P=0,95

Q (P, n) =3,86 при n=5, P=0,95

Для оценки показателя воспроизводимости методики анализа рассчитывают общее среднее значение результатов анализа, полученных в условиях воспроизводимости и дисперсию, характеризующую разброс средних арифметических результатов единичного анализа () относительно общего среднего значения :

 , (6)

где ∑Хi -cумма средних арифметических результатов единичного анализа.

 , (7)

Показатель воспроизводимости методики анализа в виде среднего квадратичного отклонения  для содержаний, соответствующих содержанию компонента в m-ном ОО, рассчитывают по формуле:

 , (8)

Показатель воспроизводимости методике анализа в виде предела воспроизводимости R для содержаний, соответствующего содержанию компонента в m-ном ОО, рассчитывают по формуле:

R = Q (P, 2) (9)

. (10)

2. Экспериментальная часть

.1 Исходные реактивы, материалы и используемая аппаратура

РН-ионометр "Экотест-120".

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919-83.

Платиновый комбинированный эдектрод.

Весы лабораторные ВЛР-200, 2 класса точности ТУ 25-06-1131-75.

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100, 250, 500 см³, 2 класса точности по ГОСТ 1770-74.

Пипетки вместимостью 1, 2, 5, 10 см³, 2 класса точности по ГОСТ 20292-74.

Бутылки стеклянные вместимостью 100, 250, 500 см³.

Стаканы химические вместимостью 50 и 100 см³ по ГОСТ 1770-74.

Гексацианоферрат (II) калия, имп.

Гексацианоферрат (III) калия, имп.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный., чда

Однозамещенный фосфорнокислый калий, чда

Кислота аскорбиновая, имп.

Катехол, имп.

Кверцетин по ТУ 6-09-10-745-78.

Галловая кислота, имп.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

2.2 Приготовление рабочих растворов

.2.1 Приготовление раствора K₃[Fe(CN)₆] с концентрацией 1 моль/дм³

На аналитических весах взвешивают 8,23125 г K₃[Fe(CN)₆] с погрешностью 0,00025 г, переносят в мерную колбу на 100 см³ и доводят объем до метки дистиллированной водой.

.2.2 Приготовление раствора K₄[Fe(CN)₆] с концентрацией 0,01 моль/дм³

На аналитических весах взвешивают 0,10555 г K₄[Fe(CN)₆] с погрешностью 0,00025 г, переносят в мерную колбу на 100 см³ и доводят объем до метки дистиллированной водой.

.2.3 Приготовление K-Na фосфатного буферного раствора с концентрацией 0,015 моль/дм³ (рH=7,4)

Смешивают 496,8 см³ раствора А и 193,2 см³ раствора Б.

Приготовление раствора А: На аналитических весах взвешивают 13,71900 г Na₂HPO₄*2H₂O (Mr=177,99 г/моль), переносят в мерную колбу на 500 см³ и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Приготовление раствора Б: На аналитических весах взвешивают 2,26950 г KH₂PO₄ (Mr=136,09 г/моль), переносят в мерную колбу на 250 см³ и доводят объем до метки дистиллированной водой.

.2.4 Приготовление рабочего раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 0,1 моль/дм³

На аналитических весах взвешивают 1,76 г аскорбиновой кислоты, переносят в мерную колбу на 100 см³ и доводят объем до метки дистиллированной водой.

2.2.5 Приготовление рабочего раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 0,01 моль/дм³

Раствор аскорбиновой кислоты с концентрацией 0,01 моль/дм³ готовят разбавлением рабочего раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 0,1 моль/дм³ в колбе вместимостью 100 см³

.2.6 Приготовление рабочего раствора галловой кислоты с концентрацией 0,1 моль/дм³

На аналитических весах взвешивают 0,01 г галловой кислоты, переносят в мерную колбу на 100 см³ и доводят объем до метки дистиллированной водой.

.2.7 Приготовление рабочего раствора галловой кислоты с концентрацией 0,001 моль/дм³

Раствор галловой кислоты с концентрацией 0,001 моль/дм³ готовят разбавлением рабочего раствора галловой кислоты с концентрацией 0,1 моль/дм³ в колбе вместимостью 100 см³.

.2.8 Приготовление рабочего раствора катехола с концентрацией 0,1 моль/дм³

На аналитических весах взвешивают 1,1011 г катехола, переносят в мерную колбу на 100 см³ и доводят объем до метки дистиллированной водой.

.2.9 Приготовление рабочего раствора катехола с концентрацией 0,01 моль/дм³

Раствор катехола с концентрацией 0,01 моль/дм³ готовят разбавлением рабочего раствора катехола с концентрацией 0,1 моль/дм³ в колбе вместимостью 100 см³.

2.2.10 Приготовление рабочего раствора кверцетина с концентрацией 0,1 моль/дм³

На аналитических весах взвешивают 0,01120 г кверцетина, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем до метки этиловым спиртом.

.2.11 Приготовление рабочего раствора кверцетина с концентрацией 0,01 моль/дм³

Раствор кверцетина с концентрацией 0,01 моль/дм³ готовят разбавлением рабочего раствора кверцетина с концентрацией 0,1 моль/дм³ в колбе вместимостью 100 см³ спиртом.

.2.12 Подготовка пробы чая к анализу

Пробоподготовка проводится в соответствии с ГОСТ 19885-74 [36]. 2,5 г предварительно измельченной навески чая, взятой из средней пробы, с погрешностью взвешивания не более 0,0002 г, помещают в колбу 250 см³, приливают 200 см³ кипящей дистиллированной воды и ставят на водяную баню. Экстракцию ведут в течение 45 минут. Экстракт фильтруют в колбу вместимостью 500 см³ , фильтрат переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³, охлаждают и доводят дистиллированной водой до метки.

.3 Методика выполнения анализа

В стеклянный стакан вместимостью 50 см³ вносили 19,6 см³ K-Na фосфатного буферного раствора (pH=7,4), затем добавляли по 0,2 см³ раствора K₃[Fe(CN)₆] и раствора K₄[Fe(CN)₆]. Погружали в ячейку электрод и выдерживали систему до установления значения потенциала, который далее считался начальным и обозначали его Е. Потом добавляли n мл исследуемого объекта и измеряли потенциал при разном времени (t от0,5 мин до 60 мин). Рассчитывали активность антиоксидантов в растворе в соответствие с формулой :

=(α*Cox-Cred)/1+α, (11)

где Е, Е₁-потенциалы,устанавливающиеся в системе до и после введения анализируемого источника антиоксиданта, В;

Е₀-стандартный потенциал медиаторной системы,В;

С_ох-концентрация окисленной формы медиатора, моль экв./дм³;

С_red-концентрация восстановленной формы медиатора, моль экв./дм³;

Х-эквивалентная концентрация антиоксидантов,вступивших во взаимодействие с окисленным компонентом медиаторной системы, моль экв./дм³;

α=10^(Е-Е1)/bС_red/С_ох,b=2,3RT/nF,n=1.

В процессе анализа ионная сила раствора практически не изменяется и источником информации является изменение потенциала, а не его абсолютная величина, достаточно корректно не делать разницы между активностью и концентрацией. Далее именно эта величина используется для характеристики антиоксидантной активности.

3. Результаты и их обсуждение

Известен потенциометрический метод определения антиоксидантной активности, который имеет ряд преимуществ. В отличие от большинства методов определения АОА не используется вещество-стандарт.

Однако в потенциометрии важна величина скачка потенциала, поэтому были поставлены следующие вопросы:

Определять АОА при фиксированном времени или ждать установления постоянного потенциала?

Что характеризует определяемый по данному методу показатель-величину АОА или суммарное содержание антиоксидантов?

Объектами исследования являлись антиоксиданты - фенольного типа с разной структурой - галловая кислота (ГК), кверцетин (КВ) и катехол (КТ); и антиоксиданты не фенольного типа - аскорбиновая кислота (АК). Эти индивидуальные антиоксиданты входят в состав пищевых продуктов и определяют их антиоксидантные свойства (рисунок 1).

Рисунок 1 - Структура объектов исследования

Для решения поставленных вопросов изучали зависимость изменения потенциала в окислительно-восстановительной системе Fe(II)/Fe(III)-антиоксидант от времени. Во всех случаях в качестве индикаторной использовалась система K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆] с соотношением концентраций Fe(II)/Fe(III) 1:100.

Условия определения АОА:

- 19,6 см³ K-Na фосфатный буфер, pH=7,4;

- 0,2 см³ [K₃(CN)₆] c концентрацией 1 моль/дм³;

- 0,2 см³ [K₄(СN)₆] c концентрацией 0,01 моль/дм³;

- в качестве рабочего электрода-комбинированный платиновый НПО "Измерительная техника ИТ";

- n см³ пробы или восстановителя;

- t от 0,5 мин до 60 мин.

Исходный потенциал в системе устанавливался в течение 3-5 минут и практически не изменялся в течение часа. Изучали изменение потенциала в течение 60 минут интервалом 1 минута первые 10 минут и 10 минут в последующий период времени.

Рассматривая полученные зависимости, установили, что в независимости от величины скачка потенциала наблюдается его увеличение во времени (рисунок 2).

Рисунок 2 - Графики зависимости ∆Е от времени для различных антиоксидантов

Изменение потенциала зависит от природы антиоксиданта, так для АК нарастание сигнала составляет около 92 % за 15 минут, в то время как для КТ при таких же его концентрациях в системе эта величина составляет около 80% (таблица 2).

Таблица 2 - Значение ∆Е различных антиоксидантов при разном времени

Вос-ль	С, ммоль/дм3	∆Е за 3 мин, мВ	∆Е за 5 мин, мВ	∆Е за 15 мин, мВ
АК	0,024	9,3	9,5	10,7
АК	0,099	24,4	24,6	26,0
АК	0,380	52,3	52,5	55,0
ГК	0,070	34,4	34,6	35,2
ГК	0,120	44,3	45,0	47,5
ГК	0,240	64,9	65,7	68,6
КВ	0,010	12,8	13,0	13,8
КВ	0,020	21,9	22,5	24,3
КВ	0,050	44,4	45,2	47,1
КТ	0,100	29,5	31,8	39,9
КТ	0,150	40,9	44,2	54,0
КТ	0,240	51,2	54,6	65,8

При введении в систему равных концентраций (в моль экв.) антиоксидантов разной природы получены разные по величине изменения потенциала индикаторной системы после введения антиоксидантов. "Скорость" изменения величины ∆Е для всех антиоксидантов во всех случаях носит линейный характер. "Скорость" изменения этой величины возрастает в ряду КВ<АК<ГК<КТ (рисунок 4).

	ГК	y=0,2711x+32,815
	КТ	y=0,7643x+28,681
	АК	y=0,0779x+24,506
	КВ	y=0,0261x+12,905

Рисунок 4 - График зависимости ∆Е от времени при одинаковой концентрации восстановителя

"Скорость" изменения потенциала во времени для смесей (например, АК+ГК) восстановителей носит линейный характер, но по величине ниже теоретической (рисунок 5). Относительная погрешность не более 30 %.

Рисунок 5 - График зависимости ∆Е от времени для смеси АК+ГК

Результаты значений ∆Е смесей антиоксидантов представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты значений ∆Е смесей антиоксидантов

Сао, мольэкв/л				∆Епракт,мВ	∆Етеор,мВ	|∆|,%
ГК	АК	КТ	КВ
0,00015	0,0001	-	-	39,1	58,6	36,18
0,0003	0,0001	-	-	51,3	72,4	30,39
0,0007	0,00015	-	-	66,8	61,3	34,09
0,00015	-	0,0001	-	40,4	63,1	20,44
0,0003	-	0,0001	-	52,5	86,5	29,83
-	0,0001	0,0001	-	24,8	51,5	28,93
-	0,0001	0,0002	-	38,3	65,3	19,91
-	0,00015	0,0005	-	54,4	60,3	21,89
-	-	0,0001	0,0002	47,1	62,1	9,82
-	-	0,0001	0,0005	55,9	85,5	17,89
-	-	0,0005	0,0002	70,2	92,7	20,28

Для всех антиоксидантов и реального образца рассчитан рост потенциала. 15 минут использовали в качестве контрольного времени. Как видно, для всех антиоксидантов потенциал достигает приблизительно 99 % от максимального (таблица 4).

Изменение потенциала приводит к возрастанию рассчитанной величины АОА. Для суммарного показателя, каким является величина АОА, необходимо выбрать условия, когда вклад различных индивидуальных антиоксидантов в суммарную величину будет максимальным.

Таблица 4 - Изменение аналитического сигнала во времени

t,мин	∆,%
	АК	ГК	КВ	КТ	ВИНО
3	99,4	98,9	99,1	96,6	99,0
5	99,5	99,1	99,4	97,2	98,6

При выбранном фиксированном времени 5 мин была рассчитана "АОА". Как видно, погрешность определения концентрации для индивидуальных восстановителей составляет для АК 12 %, КВ 37 %, ГК 21 % и КТ 9 % (таблица 5).

Таблица 5 - Метод "введено-найдено" для индивидуальных антиоксидантов

АО	Введено, мМэкв/л	Найдено, мМэкв/л	∆,%
АК	0,189	0,167	12,0
АК	0,122	0,102	15,7
АК	0,296	0,268	9,0
КТ	0,139	0,122	12,0
КТ	0,198	0,210	5,8
ГК	0,370	0,456	23,4
ГК	0,732	0,968	32,3
ГК	0,208	0,225	7,4
КВ	0,049	0,067	35,2
КВ	0,098	0,136	39,2

Дополнительно были изучены смеси антиоксидантов в различных концентрационных соотношениях и рассчитана величина АОА (таблица 6).

Таблица 6 - Метод "введено-найдено" для смесей антиоксидантов

Состав смеси	Введено, мМэкв/л	Найдено, мМэкв/л	∆,%
АК+ГК	0,2	0,3	36,0
	0,4	0,6	47,5
	0,9	1,1	30,6
ГК+КТ	0,2	0,4	44,0
	0,4	0,6	57,5
КТ+АК	0,2	0,2	20,0
	0,3	0,3	10,0
	0,6	0,7	13,3
КВ+КТ	0,6	0,7	20,0

Таким образом, можно говорить, что в данных условиях эксперимента величины АОА и содержания антиоксиданта, вероятно, будут приближаться. И определяемая величина характеризует активность компонентов, т.е. это АОА. На примере вин при выбранном фиксированном времени были рассчитаны величины АОА. Как видно, значения для реального объекта различаются на 8%. Поэтому для возможности сравнения величин АОА различных вин необходимо вести определение при фиксированном времени (таблица 7).

Таблица 7 - Результаты определения АОА вина

Вино	АОА , мМэкв/л
	3 мин	5 мин	15 мин
Мерло NR	0,135±0,002	0,147±0,004	0,176±0,002

Для проверки правильности определения АОА пищевых продуктов методом FRAP с потенциометрическим детектированием был проведен расчет показателей прецизионности согласно РМГ 61-2003. Для каждого образца в условиях внутрилабораторной прецизионности было получено 10 сходимых результатов определения АОА (Приложение А), каждое из которых представляет среднее двух параллельных определений (таблица 8).

Таблица 8-Метрологические характеристики

Наимено-вание определяе-мого компонен-та	Пище-вой продукт	Показатель повторяе-мости (СКО повторяе-мости),%	Предел повторяемос-ти (для 2-х результатов параллельных определений),% r	Показатель воспроизводи-мости (СКО воспроизводи-мости),%	Предел воспроиз-водимости (для 2-х результа-тов измерений), % R
суммарное содержа-ние антиокси-дантов	Вино "Caber-net" Фанаго-рия	7	19	1	23
	Чай "Крас-нодарс-кий"	4	11	3	13

Заключение

      Проведена оценка правильности определения суммарного содержания антиоксидантов в пищевых продуктах методом FRAP с медиаторной системой K₃[Fe(CN)₆]/ K₄[Fe(CN)₆] с потенциометрическим детектированием.

2       На основании литературных и экспериментальных данных показано, что на правильность потенциометрического определения содержания антиоксидантов с медиаторной системой K₃[Fe(CN)₆]/ K₄[Fe(CN)₆] оказывает влияние стабильность потенциала и время его установления. Установлено, что за 15 минут аналитический сигнал достигает 99% от максимального значения не зависимо от природы антиоксиданта и его концентрации. Измерение потенциала после внесения антиоксиданта или аликвоты пробы необходимо проводить при фиксированном времени (5±1) минут.

         Методом FRAP с потенциометрическим детектированием определена антиоксидантная активность вина сухого красного наименования "Cabernet NR" и чая черного наименования "Краснодарский", которая составила (14,3±0,4) и (8,3±0,3) ммоль/дм³, соответственно.

         Проведена метрологическая аттестация методики определения суммарного содержания антиоксидантов в чае черном и вине сухом красном. Получены следующие показатели прецизионности: для вина:Sr=7%; r=19%; R=23%; S_R=1%; для черного чая : Sr=4 %; r=11 %; R=13%; S_R=3%

Список использованных источников

1 Будников, Г.К. Антиоксиданты как объекты биоаналитической химии / Г.К. Будников, Г.К. Зиятдинова // жур. аналит. химия.- 2005.-Т.60, № 7.-С. 678-691.

Дурнев, А.Д. Мутагены. Скрининг и фармакологическая профилактика воздействий/ А.Д. Дурнев, С.В. Серединин. - М.: Медицина, 1998.- 326 с.

Решетняк, Л.П. Пути улучшения качества и сохраняемости пищевых продуктов/Л.П. Решетняк, Н.И. Пилипеньо, Т.В. Пилипенко - Л.: Лист, - 1988.- 329 с.

Ehlenfeldt, M.K. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and phenolic and anthocyanin concentrations in fruit and leaf tissues of highbush blueberry/ M.K Ehlenfeldt, R.L Prior // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2001. - V.49. - P.2222-2227.

Chung , S.-K. Hydroxy radical scavengers from white mustard/ S.-K Chung, T. Osawa// Food Science and Biotechnology.- 1998.-V.7. - № 4. - P.209-213.

Владимиров, Ю.А. Физико-химические основы фотобиологических процессов / Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко. - Москва, Высшая школа, 1989. - 350с.

Чугасова, В.А. Антиоксиданты природные и синтезированные / В.А. Чугасова // лекторий.-1998.-С.18-23.

Яшин, Я.И. Природные антиоксиданты. Содержание в пищевых продуктах и их влияние на здоровье и старение человека/Я.И. Яшин. - М.:Транслит, 2000. - 212 с

Абдулин, И.Ф. Органические антиоксиданты как объекты анализа (обзор) / И.Ф. Абдулин, Е.Н. Турова, Г.К. Будников // заводская лаборатория. Диагностика материалов.-2001.- Т.67, № 6.- С. 3-12.

Nohl, H. Oxigan radical release in mitochondria: influence of age/ H. Nohl // In: Free radical, Aging and Degenerative Disease.- 1986. -. № 8. - Р. 77-97.

Рогинский, В.А. Фенольные антиоксиданты: реакционная способность и эффективность/В.А. Рогинский. - М.: Наука, 1988.-247с.

Лапин, А.А. Антиоксидантные свойства производств растительного происхождения/ А.А.Лапин, М.Ф. Борисенков, А.П. Карманов и др//Химия растительного сырья-2007.-№2.-С.79-83.

Яшин, А.Я. Экспрессный электрохимический метод определения антиоксидантной активности пищевых продуктов / А.Я. Яшин, Я.И.Яшин //наука - производству.-2004. - №6. - С.32-34.

Короткова, Е.И. Новый способ определения активности антиоксидантов/ Е.И. Короткова // Журнал физической химии.-2000.-Т.74. - №9. - С.1544-1546.

15 Korbut, O. Damage to DNA indicated by an electrically heated DNA-modified carbon paste electrode / O. Korbut, M. Buckova, P. Tarapcik, J. Labuda, P. Grundler // Journal of Electroanalytical Chemistry. - 2001. - V.506. - P.143-148.

Rosiak, D. Chemiluminescence detection of peroxyl radicals and comparision of antioydant activity of phenolic compounds / D., Rosiak, K. Czkapiak, M. Lukaszewicz //Сurrent topice in Biophysics. - 2000.- V.24. - P.89-95.

Cao, G. Procyanidins, anthocyanins and capacity in wines / G. Cao, C. Sanchez-Moreno, R.L. Prior // Faseb Journal. - 2000.- V.14.- P. 564-568.

Розанцев, Э.Г. Органическая химия свободных радикалов / Э.Г. Розанцев, Д. Нонхибел.- М.: Химия, 1979.- 334с.

Rice-Evance, C. Analysis of vitamin E homologs in plasma and tissue: High-performance liquid chromatography / C. Rice-Evance, N.J. Miller // Meth. Enzymol. - 1994. - V. 234. - P. 279-293.

Шарафутдинова, Е.Н. Оценка антиоксидантной активности пищевых продуктов методом потенциометрии / Е.Н. Шарафутдинова, А.В. Иванова, Х.З. Брайнина // Известия вузов. Пищевая технология.-2004, № 4.- С. 27-29.

Шарафутдинова, Е.Н. Потенциометрия в исследовании антиоксидантной активности объектов растительного происхождения: автореф. дис. … канд. хим. наук. / Шарафутдинова Е.Н. - Екатеренбург, 2004. - 22с.

22 Benzie, I.F. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power: the FRAP assay/ I.F Benzie, J.J Strain //Analitical Biochemistry.-1996.-V.239.- P.70-76.

Шарафутдинова, Е.Н. Потенциометрический метод определения антиоксидантной активности: оценка основных метрологических характеристик / Е.Н. Шарафутдинова, А.В. Иванова, Х.З. Брайнина и др. // Заводская лаборатория-2008.-Т. 74. - № 6.- С. 9-14.

Glazer, A.N. Phycoerythrin fluorescence-based assay for reactive oxygen species/A.N. Glazer //Methods of Enzymology.-1990.-V.186. - P.161-168.

25 Дубинина, Е.Е. Окислительная модификация белков в плазме крови больных психическими расстройствами (депрессия, деперсонализация) / Е.Е. Дубинина // Вопросы медицинской химии.-2001.-Т.47. - №6. - С.561.

Короткова, Е.И. Вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов /Е.И. Короткова // Журн.физ.химии. - 2000. -Т.74. - №9. - С.1704-1706.

Абдулин, И.Ф. Определение некоторых жирорастворимых антиоксидантов методом гальваностатической кулонометрии /И.Ф.Абдулин, Е.Н.Турова, Г.К.Будников, Г.К.Зиятдинова // жур.аналит.химии. - 2002.-Т.58. - №8. - С.864-866.

Хасанов, В.В. Методы исследования антиоксидантов / В.В. Хасанов, Г.Л. Рыжова, Е.В. Мальцева // Химия растительного сырья.-2004. -№3. -С.63-75.

Ивановская, Е.А. Определение аскорбиновой кислоты в биологических средах методом инверсионной вольтамперометрии / Е.А. Ивановская, Р.С. Карпов// Жур. аналит. химии. -1997.-Т.52. - №7. - С.773-774.

Темердашев, З.А. Определение суммарного содержания антиоксидантов методом FRAP/ З.А.Темердашев, Т.Г. Цюпко, Н.А. Николаева и др.// Жур.аналит. химии. - 2011. - Т.15. - №3. - С.287-297.

Макарова, Н.В. Антиоксидантная активность цитрусовых плодов/Н.В. Макарова, А.В. Зюзина, Ю.И. Мирошкина// Известия вузов. Пищевая технология.-2010. - № 1.- С. 5-7.

Макарова, Н.В. Антиоксидантная активность яблок различных сортов/ Н.В. Макарова, А.В. Зюзина// Известия вузов. Пищевая технология.-2010. - № 4. - С. 31-33.

Бординова, В.П. Антиоксидантные свойства зерна ячменя, овса, сорго, риса и продуктов их переработки / В.П. Бординова, Н.В. Макарова// Известия вузов. Пищевая технология. - 2011. - № 5-6.- С. 5-7.

РМГ 61-2003. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки. - Введ.2005- 01-01.-М.:ФАТРиМ: Изд-во стандартов, 2005.-38 с.

ГОСТ Р ИСО 5725- 2-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений.- Введ. 2002-23-04.-М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2002.- 44с.

ГОСТ 19885-74. Чай. Методы определения содержания танина и кофеина.- Введ. 1974-25-06.-М.:Стандартинформ, 2009.- 5с.

Приложение А

Результаты для оценивания прецизионности черного чая и сухого красного вина

Таблица 1- Результаты для оценивания прецизионности черного чая

Х1

Х2

Хi

1

8,662

8,625

8,643

2

8,607

8,380

8,493

3

8,450

8,625

8,527

4

8,379

8,732

8,555

5

8,607

8,310

8,458

6

8,696

8,449

8,572

7

8,572

8,660

8,616

8

8,434

8,362

8,397

9

8,434

8,432

8,432

10

8,678

8,572

8,625

Таблица 2 - Результы для оценивания прецизионности сухого красного вина

№Х1Х2Хi
1	8,662	8,625	8,643
2	8,607	8,380	8,493
3	8,450	8,625	8,527
4	8,379	8,732	8,555
5	8,607	8,310	8,458
6	8,696	8,449	8,572
7	8,572	8,660	8,616
8	8,434	8,362	8,397
9	8,434	8,432	8,432
10	8,678	8,572	8,625