Материал: Оценка правильности определения суммарного содержания антиоксидантов в пищевых продуктах методом Frap с потенциометрическим детектированием

Оценка правильности определения суммарного содержания антиоксидантов в пищевых продуктах методом Frap с потенциометрическим детектированием

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

"КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ"

(ФГБОУ ВПО "КубГУ")

Кафедра аналитической химии

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА

Оценка правильности определения суммарного содержания антиоксидантов в пищевых продуктах методом Frap с потенциометрическим детектированием

Краснодар 2014

Содержание

Введение

. Аналитический обзор

.1 Общие понятия об антиоксидантах

.2 Синергизм антиоксидантов

.3 Классификация антиоксидантов

1.4 Методы исследования антиоксидантов

.5 Антиоксидантные свойства некоторых пищевых продуктов

.6 Оценка показателей прецизионности (повторяемости и воспроизводимости) и точности методики анализа

. Экспериментальная часть

2.1 Исходные реактивы, материалы и используемая аппаратура

.2 Приготовление рабочих растворов

.2.1 Приготовление рабочего раствора K₃[Fe(CN)₆] с концентрацией 1моль/дм³

.2.2 Приготовление рабочего раствора K₄[Fe(CN)₆] с концентрацией 0,01 моль/дм³

.2.3 Приготовление К-Na фосфатного буферного раствора с концентрацией 0,015 моль/дм³ (pH=7,4)

.2.4 Приготовление рабочего раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 0,1моль/дм³

.2.5 Приготовление рабочего раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 0,01моль/дм³

.2.6 Приготовление рабочего раствора галловой кислоты с концентрацией 0,1 моль/дм³

.2.7 Приготовление рабочего раствора галловой кислоты с концентрацией 0,001 моль/дм³

.2.8 Приготовление рабочего раствора катехола с концентрацией 0,1 моль/дм³

.2.9 Приготовление рабочего раствора катехола с концентрацией 0,01 моль/дм³

.2.10 Приготовление рабочего раствора кверцетина с концентрацией 0,1 моль/дм³

.2.11 Приготовление рабочего раствора кверцетина с концентрацией 0,01 моль/дм³

.2.12 Подготовка пробы чая к анализу

.3 Методика выполнения анализа

3. Результаты и их обсуждение

Заключение

Список использованных источников

Приложение

антиоксидант пищевой проба чай

Введение

В современном мире всё чаще встречаются такие болезни, как раковые заболевания, диабет, артрит, катаракты и др. Эти и многие другие болезни могут быть вызваны свободными радикалами (СР) - это окислители, пагубно влияющие на организм человека. Радикалом считается химическое соединение, имеющее один или более неспаренных электронов, образованное либо в результате потери, либо приобретения одного электрона.

Соединения, способные связывать содержащие неспаренные электроны частицы с образованием менее активных или вовсе неактивных радикалов, называют антиоксидантами. Питание является фактором, определяющим здоровье человека. Основными источниками антиоксидантов являются продукты растительного происхождения. Фрукты, овощи и продукты питания, произведенные на их основе, содержат большое количество веществ, способных выступать в качестве антиоксидантов.

Определение антиоксидантной активности (АОА) весьма важно для медицины, фармакологии, производства пищевых продуктов и биодобавок. В настоящее время для определения АОА пищевых продуктов широко применяется метод FRAP. Однако не установлены метрологические характеристики метода.

Поэтому целью работы являлась оценка правильности определения суммарного содержания антиоксидантов в пищевых продуктах методом FRAP с потенциометрическим детектированием.

Работа выполнена на оборудовании ЦКП "Эколого-аналитический центр".

1. Аналитический обзор

.1 Общие понятия об антиоксидантах

В настоящее время резко возрос, прежде всего, интерес к изучению процессов свободнорадикального окисления в связи с признанием инициирующей роли свободных радикалов в процессах старения организма и в развитии таких патологий как ишемическая болезнь сердца, атеросклероз, катаракта, онкологические заболевания, вирус иммунодефицита человека и др.[1]. Установлено также, что свободные радикалы, в частности, активные формы кислорода, воздействуют и на геном человека, вызывая ряд наследственных аутосомно-рецессивных болезней [2].

Защита организма от воздействия радикалов осуществляется антиоксидантами (АО). АО - вещества различной химической природы, способные тормозить или устранять неферментативное свободно радикальное окисление органических соединений различными формами кислорода [1]. К исследованию антиоксидантов, как одних из биологически активных веществ, большой интерес прежде всего проявляли специалисты, работающие в области наук о жизни, нежели к собственно аналитике.

Установлено, что свободные радикалы, в частности, активные формы кислорода, воздействуют на геном человека, вызывая целый ряд аутосомно-рецессивных болезней [3]. В здоровом организме сохраняется равновесие в системе оксиданты-антиоксиданты. Нарушение этого баланса в пользу оксидантов приводит к развитию окислительного стресса. В результате окислительно-восстановительной реакции постоянно генерируются активные формы кислорода, обладающих высокой реакционной способностью, что вызывает повреждение белков, нуклеиновых кислот, ферментов, биомембран, что, в конечном итоге, приводит к развитию патологических состояний. Воздействия антиоксидантов приводит к условиям для обеспечения нормального роста клеток и тканей.

Присутствие в клетках антиоксидантов обеспечивает еще один очень важный механизм: антиоксиданты быстро реагируют со свободными радикалами и, жертвуя собой, предохраняют более важные элементы клетки от повреждений. Основными антиоксидантами являются витамины С и Е, а также полифенолы, например, флавоноиды, которые поступают в организм с пищей.

Основные источники антиоксидантов в пище - фрукты, овощи, чай и вино. При этом красное вино содержит более 200 известных производных фенолов, таких как флавоноиды, танины и т.д. [4]. Чаще всего окислительный стресс вызывается УФ излучением, которое не только индуцирует свободнорадикальное окисление, но и нарушает работу ферментных антиоксидантов кожи.

.2 Синергизм антиоксидантов

Антиоксиданты, как правило, оказывают положительный эффект в больших дозах. С другой стороны, известно, что большинство соединений данной группы характеризуется двухфазным действием, т.е. антиоксидантный эффект при повышении некоторой пороговой величины сменяется прооксидантным [5]. Необходимость использования больших концентраций антиоксидантов объясняется тем, что молекула антиоксиданта разрушается при реакции со свободными радикалами и выбывает из игры. Для того, чтобы антиоксидант эффективно работал, необходимо присутствие восстановителей, которые будут переводить его в активное состояние. Например, витамин С восстанавливает витамин Е, но сам при этом окисляется [6]. Тиоловые соединения восстанавливают витамин С, а биофлавоноиды восстанавливают как витамин Е, так и витамин С. Такой же синергизм наблюдается между витамином Е и селеном.

Таким образом, функциональный синергизм антиоксидантов позволяет добиваться максимального защитного эффекта и высокой стабильности препарата при меньшей концентрации антиоксидантов. В настоящее время ведутся интенсивные исследования по изучению взаимодействия различных антиоксидантов в организме, которые позволят создавать оптимальные антиоксидантные композиции. Можно прогнозировать, что человек, решая проблему антиоксидантов, по-видимому, не сможет изобрести ничего нового и вынужден будет признать, что уникальные композиции, созданные природой, не нуждаются в усовершенствовании.

1.3 Классификация антиоксидантов

В настоящее время существует несколько классификаций антиоксидантов. Наиболее известные классификации приведены ниже.

1 По природе антиоксиданты:

- природные;

- синтезированные (производные природных антиоксидантов).

По механизму действия антиоксидантов:

- "мусорщики", которые очищают организм от всех свободных радикалов, чаще всего восстанавливая их до стабильных неактивных продуктов;

- "ловушки" - антиоксиданты, которые имеют средство к какому-то определенному свободнорадикальному продукту (ловушки синглетного кислорода, гидроксил-радикала и т.д.). Ловушки часто используют для уточнения механизма свободнорадикальной реакции;

- антиоксиданты, обрывающие цепи - вещества, молекулы которых более реакционноспособны, чем их радикалы. Чаще всего это фенолы, которые легко отдают свои электроны, превращая радикал, с которым они прореагировали, в молекулярный продукт, а сами при этом превращаются в слабый феноксил-радикал, который уже не способен участвовать в продолжении цепной реакции [7].

Самыми известными и широко употребляемыми в 20-м веке были синтетические антиоксиданты. Наиболее типичными представителями синтетических антиоксидантов являютя: ионол, фенозаны, оксипиридины, селен-неорганические и селен-органические соединения. Однако в последнее время они стали уступать место природным антиоксидантам.

Природные антиоксиданты [8], делят на:

Ферментные - катализируют реакции, в которых активные формы кислорода и некоторые другие окислители восстанавливаются до стабильных нетоксичных продуктов. Ферментные антиоксиданты практически все всегда выполняют свою функцию внутри клетки. Их синтез и внутриклеточное содержание, как и большинства белков, находится под генетическим контролем и интенсифицируется под влиянием ряда внешних воздействий, к которым относятся и фармакологические (введение лекарственных препаратов). Большая молекулярная масса молекул энзимов препятствует их выходу за пределы клеток, одновременно это же и является препятствием для проникновения внутрь клетки и введенным в организм в виде лекарственных препаратов экзогенных ферментов и белков (например, СОД, церебролизин, актовегин и др.). В случае же попадания ферментных антиоксидантов и белков в кровь (цитолиз клеток, введение извне в виде лекарств), они не могут рассматриваться в качестве ключевых механизмов в антирадикальной и антиперекисной защите крови, так как очень быстро, в течение 5 - 10 минут разрушаются под действием протеаз крови или выводятся в неизмененном виде почками [9]. В результате уровень ферментных АО крови крайне низок и суммарно определяет менее 1% ее антирадикальной и антиперекисной активности.

Макромолекулярные - это некоторые белки, являющиеся важнейшей составной частью сыворотки крови. Одним из типичных представителей высокомолекулярных антиоксидантов является сывороточный альбумин. Он синтезируется в печени и секретируется ее клетками в кровь [10].

3       Низкомолекулярные - наиболее часто встречающиеся в составе различных растений.

Низкомолекулярные антиоксиданты делятся на:

Водорастворимые - аскорбиновая кислота, природные полифенольные соединения (флавоноиды, оксиароматические кислоты,катехоламины, индоламины, производные кумаринов, фитоэстрогены, тиоловые соединения, некоторые олигопептиды.

Жирорастворимые - антиоксиданты группы витамина Е, витамины А и К, стероидные гормоны, флавоноиды, полифенолы (убихинон, витамин Р).

Рассмотрим наиболее распространенные низкомолекулярные природные антиоксиданты более подробно.

Витамин Е (α-токоферол) - является основным антиоксидантом биологических мембран липопротеиновых комплексов, защищает геном при перехвате активных форм кислорода (АФК) в клеточном ядре (антимутагенное действие). Участвует в антиоксидантной защите липопротеидов сыворотки крови, образуя токоферольный радикал, который восстанавливается до токоферола с участием аскорбиновой кислоты и глутатиона; одновременно осуществляется перенос радикалов из гидрофобной фазы липидного биослоя в водную фазу, что и обеспечивает постоянную нейтрализацию АФК в биологических мембранах.

Молекула токоферола эффективно взаимодействует с большинством АФК и продуктов липиды низкой плотности (ПОЛ), находящихся в липидной фазе.

Витамины А, К, стероидные гормоны. Витамин А и его провитамины- бета-каротин и другие каротиноиды также относятся к жирорастворимым фенольным антиоксидантам. В организме содержится в одной из 3-х форм - ретинол, ретиналь, ретиноевая кислота[11].

Витамин А и его производные проявляют выраженное антиоксидантное действие и обеспечивают разрушение основных видов АФК; участвуют в обеспечении и регуляции процессов микросомального окисления, ингибируют метаболическую активацию канцерогенов. Основными точками приложения физиологического действия витамина А в организме являются защита биологических мембран, синтез и метаболизм гликопротеинов, хроматина, биотрансформация ксенобиотиков, а также антиоксидантная защита фоторецепторов сетчатки и самого процесса восприятия зрительной информации. Витамин А и другие каротиноиды взаимодействуют с другими антиоксидантными соединениями, усиливая и пролонгируя при этом защитные эффекты друг друга: с селеном - способствует реактивации тиоловых групп сыворотки крови, оказывает выраженное антитоксическое действие; с токоферолом - резко снижает содержание мембраноагрессивных липопероксидов сыворотки крови и препятствует последующему отложению продуктов ПОЛ в интиме аорты и других сосудов; в комплексе со специфическим цитозольным белком стимулирует процессы клеточного роста и пролиферации; в ядре - усиливает экспрессию генов, биосинтез рибонуклеиновой кислоты и белков[12].

Витамин А необходим для роста тканей в детском возрасте, осуществлении фоторецепции, функционировании иммунной системы, повышения барьерных свойств и нормальной дифференцировке эпидермиса и эпителия слизистых оболочек. Способностью противостоять избыточному ПОЛ и, соответственно, стабилизировать структуру биомембран обладают стероидные гормоны - эстрогены и глюкокортикоиды, которые из-за этого иногда называют структурными антиоксидантами.

Наибольшим антиоксидантным эффектом обладает 2-оксиэстрадиол. 17-бета-эстрадиол обладает защитным действием на эндотелий сосудов от повреждения липопротеидами низкой плотности (ЛПНП) или лизофосфаттидилхолином. Кроме этого, эстрогены эффективно ингибируют никотинамидадениндинуклеотид (НАДФН)- и аскорбат-зависимые системы ПОЛ в микросомах, повышают активность каталазы в клетках почек. В высоких дозах гидрокортизон уменьшает ПОЛ, а дезоксикортикостерон в больших дозах интенсифицирует его.

Убихинон (кофермент Q) - (вездесущий)- структурно близок к витамину Е, по действию и активности схож с ним. Образует окислительно-восстановительную систему убихинон-убихинол. Основная часть внутриклеточного убихинона содержится в митохондриях, ядре, эндоплазматическом ретикулуме и лизосомах.

Важнейшая роль внутриклеточного убихинона связана с участием в митохондриальной цепи транспорта электронов в дыхательной цепи, что предопределяет его действие как регулятора антиоксидантного гомеостаза в клетке.

Убихинон и его аналоги эффективно ингибируют супероксиданион-радикал, гидроксильный радикал, перекисные и алкоксильные радикалы и, кроме того, перехватывают радикалы токоферола (витамин Е), являются одним из основных сывороточных ингибиторов синглетного кислорода.

Жирорастворимые гидрофобные антиоксидантные соединения играют главенствующую роль в защите основных структурных компонентов биологических мембран, фосфолипидов или погруженных в липидный слой белков[12], [13].

1.4 Методы исследования антиоксидантов

В настоящее время большинством авторов методы определения

антиоксидантной активности классифицируются: по способам регистрации проявляемой АОА (волюмометрические[14], фотометрические[15], хемилюминесцентные[16], флуоресцентные[17], электрохимические[18]); по типу источника окисления; по типу окисляемого соединения; по способу измерения окисленного соединения.

Однако наиболее известными методами определения антиоксидантной активности являются:

TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity): метод основан на следующей реакции:

Метмиоглобин + Н₂О₂→Феррилглобин +ABTS→ABTS*+АО.

Метод определения эквивалентов Тролокса (TEAC) основан на способности антиоксидантов восстанавливать радикальные катионы 2,2’-азинобиса (ABTS) и тем самым ингибировать поглощение в длинноволновой части спектра (600 нм). Существенным недостатком метода является двухступенчатая реакция получения радикала. Это удлиняет время проведения анализа и может увеличить разброс результатов, несмотря на то, что для анализа используют стандартизированный набор реактивов [19].