В США (Gerald Schatten с сотрудниками из Орегона) был получен трансгенный ребенок обезьяны из породы резус, что считается весьма символичным, поскольку обезьяны, как и человек, относятся к приматам (M. D. Lemonick, 2001). В данном эксперименте в геном обезьяны был введен ген свечения медузы и получен детеныш со светящейся шерстью. Новорожденный малыш назван Энди (ANDi - перевертыш от inserted DNA - введенная ДНК). Схема процесса заключалась в следующем:
1. Используя рекомбинантные ДНК технологии, ученые ввели ген медузы в поврежденный вирус.
2. Затем они инфицировали 224 яйцеклетки обезьян вирусом, надеясь, что при этом ген медузы будет включен в их ДНК.
3. Яйцеклетки были экстракорпорально оплодотворены в экспериментальных пробирках, в результате чего было получено 126 эмбрионов.
4. 40 наиболее здоровых эмбрионов были имплантированы 20 суррогатным матерям, у которых получилось 5 успешных беременностей.
5. В конце эксперимента только три детеныша родились живыми, и только один, Энди, нес введенный ген во всех клетках его тела (рис. 1).
Выведению Энди предшествовала история 20-летних исследований по получению трансгенных животных других видов:
1980 - Первая генетически модифицированная мышь, созданная путем введения нового гена в клет-ки костного мозга, а затем внедрения этих клеток в живое животное.
1986 - Рождение первых трансгенных овец, которые несли человеческий ген свертывания крови.
1990 - Рождение Гения, первого трансгенного поросенка, чья ДНК включала ген несвертываемости белка человека.
1990 - Первый трансгенный бык; бык Герман имел введенный ген лактоферина человека.
1991 - Первые трансгенные дойные коровы, которые несли ген лактоферина человека.
2001 - Объявлено о первом генетически модифицированном примате, трансгенном резусе обезьяны, названной Энди.
Наряду с выведением трансгенных животных предпринимаются попытки лечения трудноизлечимых болезней путем генной терапии. Возможно, что этот путь будет перспективным для лечения болезней нарушения иммунной системы, Альцгеймера, врожденной слепоты и др.
Одним из продуктивных направлений генетической инженерии применительно к растениям стала клеточная инженерия растений. Она основана на так называемой тотипотентности клеток, что означает сохранение их способности к делению и передифференцировке даже в зрелом состоянии. Эта способность и проявляется при культивировании растительной ткани в среде, содержащей необходимые питательные вещества и факторы роста (фитогормоны - ауксины и цитокинины). Клетки ткани дедифференцируются и начинают делиться, образуя однородную массу, так называемый каллус. Внутри каллуса формируются побеги, затем корни. Если концентрация ауксинов в среде существенно больше, чем цитокининов, то формируются только корни.
Если соотношение концентраций обратное, образуются только побеги. Культивировать можно не только ткани, но и отдельные клетки и даже изолированные протопласты. Этот метод используется в растениеводстве для размножения редких ценных или исчезающих форм. В лесном хозяйстве он используется для размножения также трудно черенкующихся лесных древесных пород. У нас он используется в основном в научных организациях. За рубежом такие работы поставлены на поток. Культивирование производится в фитотронах. При этом выделяют фермерский масштаб (0,1-1 млн микрорастений в год) и промышленный масштаб (более 1 млн микрорастений в год) (К. А. Шестибратов, 2008).
С помощью клонального микроразмножения получают также так называемые искусственные семена, полученные неполовым путем (рис. 3). Но если клонирование растений было известно давно, то клонирование млекопитающих вызвало в конце двадцатого века настоящий фурор. Стоит только вспомнить информацию о получении в 1997 году в Шотландии овечки Долли путем клонирования. Она, правда, прожила недолго (до 2003 г.), но успела родить 6 потомков (рис. 4).
После обнародования факта рождения овцы Долли клонирование животных стали производить во многих странах. Так, на Украине в 1999 году было выведено клоновым путем три телочки (Дева, Домна и Дюня). Каждая из них родила по несколько телят обычным половым путем.
В 2000 году были предприняты попытки клонировать мамонта, пролежавшего тысячелетия в вечной мерзлоте (Япония), тасманского тигра, вымершего в 1936 году (Австралия), и примата (США). Из-за низкого качества исходного репродуктивного материала попытки не увенчались успехом. В этом же году в Японии клонирован бык, который прожил несколько лет. В 2001 году в США клонирован кот Дитто, а год спустя две кошки. В 2004 году в Южной Корее клонировали человека. До рождения младенца дело не дошло, но из 100-клеточного эмбриона извлекли стволовые клетки (Аргументы и факты. 2007. № 19).
В научной литературе сообщается о получении клонов козы, кролика, коров, овец, шимпанзе и других животных (В. И. Глазко, Г. В. Глазко, 2008, Press releases, 2009). Предполагается, что будут продолжаться попытки клонировать человека (N. Gibbs, 2001).
Это может быть произведено следующим путем:
1. Врачи извлекают до 15 яйцеклеток из 40 женщин-доноров, которым ввели лекарства, повышающие фертильность. Всего извлекается 400 яйцеклеток.
2. От мужчины - кандидата на клонирование - берут клетки.
3. Ядра из каждой яйцеклетки отсасываются тонкой иглой. Затем свободные от ДНК яйца и клетки донора помещают друг возле друга и воздействуют электрическим разрядом, который вызывает их соединение. Некоторые из перестроенных яйцеклеток делятся и формируют эмбрионы.
4. Затем эмбрионы имплантируют полусотне суррогатных матерей. Поскольку эмбрионы при имплантации часто гибнут, то каждой матери вводят их несколько экземпляров сразу. От этих 50 суррогатных матерей рассчитывают получить 9-10 беременностей. Из них большинство, скорее всего, будет с неудачной беременностью, и только отдельные живые дети могут быть нормальными. А, может быть, и нет (как полагает N. Gibbs, 2001).
В целом клонирование животных и отдельных органов человека будет использоваться в первую очередь в медицинских целях. Сплав современных биотехнологий и генетики обещает существенный прорыв в неизведанное, что позволит значительно улучшить здоровье и жизнь человечества.
Разработка и применение способов получения и слияния протопластов растительных клеток, а также регенерация у них клеточной стенки в сочетании с методами культивирования и дифференцировки клеток in vitro позволили конструировать рекомбинанты, минуя половой процесс, то есть создавать соматические гибриды. Это позволяет объединять протопласты отдаленных видов растений, между которыми половая гибридизация невозможна. Труды лесоинженерного факультета ПетрГУ Первые успехи в получении соматических гибридов растений данным методом были достигнуты в середине 60-х годов двадцатого века. Вначале были выделены межвидовые гибриды (табака, моркови, петунии и дурмана). Затем удалось получить и межродовые соматические гибриды (картофель х томат, дурман х белладонна). Дальнейшие исследования в направлении соматической гибридизации и повышения стабильности выведенных организмов обещают значительный экономический эффект.
Соматические гибриды животных используются также для картирования генов в хромосомах.
Масштабы работ по генетической инженерии к настоящему времени приобрели такой размах, что это вызывает обеспокоенность экологических и некоторых политических организаций в отношении возможных негативных последствий не только собственно трансгенных растений, но и других организмов, полученных с помощью методов этой науки.
Очевидно, что эти опасения небезосновательны, как очевидно и то, что, однажды появившись, эти методы уже не исчезнут и будут только развиваться и совершенствоваться. Поэтому ничего не остается делать, как принимать какие-то меры и в первую очередь законодательного порядка по недопущению возможных негативных последствий результатов такой молодой, такой многообещающей и в то же время небезопасной науки как генетическая инженерия.
2.2 Генетически модифицированные растения
Генная инженерия возникла на стыке молекулярной биологии, биохимии и других биологических наук, она представляет собой создание генетически модифицированных растений, животных и микроорганизмов путём переноса функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), сконструированных in vitro, в ДНК модифицируемого организма. При этом рекомбинантные ДНК становятс составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства. Для переноса чужеродной информации в геном растений применяют в основном три способа трансформации: бактериальный, вирусный и агролистический. Для двудольных растений наиболее приемлем метод бактериальной трансформации. Естественным вектором горизонтального переноса чужеродной ДНК служит небольшой участок плазмиды Ti Agrobacterium tumefaciens. Этот фрагмент pTi обозначается как Т-район, когда он находится в бактериях, и Т-ДНК, когда он интегрирован в геном растения. Для трансформации устойчивых к агробактериям растений разработаны приемы прямого физического переноса ДНК в клетку, многие из которых взяты из практики работы с клетками бактерий или животных. Эти методы достаточно разнообразны, они включают: бомбардировку микрочастицами или баллистический метод; электропорацию; обработку полиэтиленгликолем; перенос ДНК в составе липосом и др. генетический инженерия растение
Для вирусной трансформации используются векторы, сконструированные на основе ДНК-содержащих вирусов, например вирус мозаики цветной капусты (Camv), поражающий семейство крестоцветных растений. Небольшой размер промотора LX35S Camv позволяет манипулировать с вирусной ДНК так же легко, как с бактериальной плазмидой. Механическая инокуляция растений приводит к заражению клеток вирусом, несущим чужеродную ДНК, практически со 100%-ной эффективностью. Агролистический метод основан на прямом введении в растительную клетку чужеродной ДНК, содержащей Т-ДНК-вектор с целевым и маркерным геном и агробактериальные гены вирулентности, каким-либо физическим методом, например, баллистическим. Временная экспрессия генов вирулентности приводит к синтезу белков, которые правильно вырезают Т-ДНК из плазмиды и встраивают ее в геном растения, как и при агробактериальной трансформации. Этот метод наиболее часто применяется для обработки зародышей злаковых растений, каллусной ткани и суспензионной культуры клеток.
Одним из основных направлений генной инженерии растений является получение модифицированных сельскохозяйственных культур, устойчивых к гербицидам. Обычно речь идёт об устойчивости к нескольким гербицидам широкого спектра действия, таким как Roundap (глифосат), Liberty (глюфосинат аммония), паракват. Клонированы гены, кодирующие нечувствительные к действию гербицидов ферменты-мишени, что дало возможность получать трансгенные растения, устойчивые к глифосфату и некоторым другим препаратам, а также изолированы гены, которые кодируют ферменты деградации некоторых гербицидов, например фосфинотрицина (BASTA). Устойчивость растений к насекомым была достигнута за счёт введения в геном растений гена bt2 из Bacillus thuringiensis, кодирующего белок, токсичный для насекомых - дельта-эндотоксин, или СRY-белок - и абсолютно безопасный для млекопитающих. В настоящее время получены так называемые Вt-растения хлопка, картофеля, кукурузы. Создание генетически модифицированных растений, устойчивых к вирусной инфекции, также является одним из приоритетных направлений фитовирусологии и генной инженерии. Показано, что экспрессия капсидных белков вируса табачной мозаики, вируса мозаики люцерны, вируса огуречной мозаики, Х-вируса
картофеля в соответствующих трансгенных растениях (табак, томаты, картофель, огурцы, перцы) обеспечивает высокий уровень их защиты от последующей вирусной инфекции. Получена трансгенная разновидность папайи SunUp с красной мякотью, устойчивая к вирусу кольцевой пятнистости папайи, в 90-х годах практически уничтожившему производство папайи на Гавайях.
В настоящее время получены генетически изменённые растения, устойчивые к стрессовым воздействиям. Важнейшей задачей является повышение адаптации растений к высоким концентрациям солей в почве. Известно, что основным осмопротектором в бактериальных и растительных клетках служит пролин. Введение в геном растений бактериальных генов биосинтеза пролина proA, proB, proC в 4-6 раз увеличивало концентрацию этой аминокислоты в клетках генетически модифицированных растений (ГМ-растений), по сравнению с контрольной группой. В результате побеги опытных растений укоренялись и могли расти при содержании солей в среде 20 г/л (350 мМ). В Калифорнийском университете (Торонто) выведен сорт томатов, устойчивых к высокому уровню солей в почве и удерживающих соль в клетках листьев так, что плоды не обретают солоноватого привкуса.
В 2002 г. в США состоялся 10-й конгресс, посвящённый культуре растительных тканей и биотехнологии растений. В ходе обсуждений было отмечено, что население земного шара к 2050 г. возрастёт до 12 млрд. человек, при этом производство продуктов питания должно быть утроено. Однако возможности сельского хозяйства ограничиваются скоростью роста популяции людей, истощением ресурсов и ухудшением качества пресной воды. Вода покрывает 70% земной поверхности, в то же время питьевая вода - 2.5% земной поверхности. При этом большая часть пресной воды находится в замороженном состоянии, менее 1% общего количества воды пригодно для использования человеком, в том числе на нужды сельского хозяйства. Производство продуктов питания также лимитируется уменьшением площади суши, пригодной для сельскохозяйственных угодий. Так, в 1977 г. на душу населения приходилось 0.26 га пахотной земли, а в 2050 г. предполагается сокращение до 0.15 га. Кроме того, урожай культурных растений зависит от влияния целого ряда биотических и абиотических факторов внешней среды. Например, применение агрохимикатов вызывает значительное засоление почвы и загрязнение воды. Обеспечить значительный рост производства сельхозпродукции с помощью традиционных агротехнических приёмов и выведения новых сортов путем классической селекции практически невозможно, поэтому в настоящее время основные надежды возлагают на генную инженерию. Первая генерация трансгенных культур была создана для повышения их устойчивости к гербицидам и насекомым (соя, хлопчатник, кукуруза), а также к вирусным инфекциям (кабачок, тыква). Удалось повысить продуктивность, а следовательно, сократить площади использованных сельскохозяйственных земель, расход воды, энергии и других ресурсов, необходимых для производства продуктов питания.