В 1969 г. в США Г. Хорана с сотрудниками синтезировали химическим путем (вне организма) первый простой по своей структуре ген. В начале 1970-х годов в нескольких американских лабораториях, а затем в лабораториях других стран, в том числе - в России (СССР), с помощью особых ферментов были синтезированы вне организма несколько более сложных генов позвоночных животных. На модельных объектах - на бактериях и культурах клеток млекопитающих удалось осуществить введение в клетку определенного гена и этим изменить в желаемую сторону ее наследственные свойства.
Многое удалось сделать для понимания молекулярных механизмов мутаций. Благодаря этому были обнаружены и изучены новые мощные химические мутагены («супермутагены»). Их эффективно использовали для получения мутантных форм микроорганизмов, растений и животных. В 70-е годы возникло учение о мутагенах в среде, окружающей человека, и сформулирована фундаментальная проблема о возможной их угрозе наследственности человечества в будущем.
Новая революция в генетике произошла в середине 70-х гг. Она была связана с новым синтезом знаний, полученных генетиками разных направлений: молекулярной и биохимической генетики, генетики бактериофагов, бактерий и плазмид, генетики дрожжей, млекопитающих и дрозофилы. Используя знания об организации наследственного аппарата различных модельных объектов, генетики разработали технологии манипуляций с генами, которые позже получили название генной инженерии.
В конце 70-х годов генетики разработали метод искусственного клонирования больших фрагментов ДНК. Это позволило размножать «в пробирке» нужные для исследований фрагменты ДНК. В середине 80-х годов был предложен ещё один метод клонирования ДНК - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Он позволяет синтезировать необходимые фрагменты ДНК и затем многократно увеличивать число их копий. Этот метод даёт возможность из незначительных количеств ДНК (из одного ядра или даже из одного гена) нарабатывать количества, необходимые для биохимического анализа. Метод уже очень широко используется, и не только в молекулярной биологии, но и в истории, этнографии и криминалистике. Например, используя ничтожные количества ДНК, содержащиеся на саркофагах и покрывалах мумий или костях предков человека, оказалось возможным наработать объемы ДНК, после анализа, которых были сделаны интересные выводы о формировании, эволюции и миграциях предков современных людей. Используя метод ПЦР для анализа ДНК из клеток, собранных на уликах, и сравнивая её с ДНК жертв и преступников, раскрывают различные преступления. ПЦР-анализы ДНК были решающими при идентификации останков семьи последнего российского императора Николая II.
Используя методы секвенирования ДНК, в 90-х гг. большие группы ученых исследуют геномы уже более чем 50 видов. В 1992 г. консорциум ученых (146 человек из 35 европейских лабораторий) сообщил о секвенировании последовательностей нуклеотидов в 3-й хромосоме дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В 1995 г. были опубликованы сведения о расшифровке геномов первых бактерий - Haemophilus influenza и Mycoplasma genitalium. В 1997 г. были секвенированы геном бактерии Escherichia coli и уже полностью - геном дрожжей S. cerevisiae. В феврале 1999 г. был секвенирован геном нематоды Caenorhabditis elegans. В марте 2000 г. группа из 200 ученых сообщила о расшифровке генома дрозофилы. Весной 2000 г. английские ученые из Кембриджа заявили, что в основном секвенировали геном человека. В начале 2001 г. геном человека был расшифрован практически полностью большой группой ученых из фирмы “Celera” (США).
После того как было открыто явление переноса генетической информации (трансформации) у прокариот (в 1944 г.), постоянно предпринимались попытки осуществить такой перенос у эукариот. В 1980 г. первые трансгенные мыши были получены инъекцией клонированной ДНК в пронуклеус оплодотворенного яйца (Дж. Гордон и др.). В том же 1980 году была предложена методика эффективной трансформации культивируемых клеток млекопитающих микроинъекцией ДНК непосредственно в ядро.
Особую известность получили эксперименты по клонированию животных. Ещё в начале 40-х гг. Г.В. Лопашов осуществил первые пересадки ядер из некоторых клеток тритона в безъядерные фрагменты цитоплазмы яиц на стадии 1-2 бластомеров. Однако эта работа не была продолжена сначала из-за войны, а затем из-за полного запрета генетики в России. В 1962 г. английский ученый Дж. Гёрдон (J. Gurdon), решил выяснить, сохраняется ли в дифференцированных клетках тот же самый набор генов, который имеет зигота. Для этого он пересадил ядра из клетки кишечника головастика в яйцо лягушки, из которого было удалено собственное ядро. В результате из такой гибридной яйцеклетки развилась нормальная лягушка. Это свидетельствовало о том, что ядра соматических и половых клеток качественно идентичны. А раз так, то в результате каждой трансплантации ядра можно получать новое животное, а трансплантации многих ядер, получение из одного животного, дают много животных, т. е. их клоны. В 1997 г. группой ученых Шотландии во главе с А. Вилмутом с помощью методики ядерных трансплантаций была получена овца, всемирно известная Долли В 1999 г. ученые из США клонировали мышь и корову, а в марте 2000 г. на свет появились сразу пять клонированных поросят. По мнению авторов этой работы, человека можно будет клонировать к 2005 г., но первые клонированные дети появились уже в январе 2003 г.
Таким образом, всего за один век (если считать от момента переоткрытия законов Менделя в 1900 г.) генетика прошла путь от формирования представлений о дискретных элементах наследственности до создания новых живых организмов методами генетических манипуляций.
Современный этап развития генетики характеризуется ее многообразным комплексированием с химией, физикой, математикой, биохимией, физиологией, экологией и другими науками. Этот синтез привел к появлению многих разделов современной генетики: молекулярной, генетики вирусов, бактерий, цитогенетики, математической, радиационной, космической, биохимической генетики, генетики популяций, физиологической, эмбриологической, экологической генетики, иммуногенетики, эволюционной генетики, частной генетики отдельных видов растений, животных, микроорганизмов, человека и т.д.
2. Генетическая инженерия
2.1 Научные познания в генетической инженерии
После переоткрытия в 1900 году законов Г. Менделя, сформулированных им еще в 1865 году, генетика стала бурно развиваться как в теоретическом, так и в практическом направлениях. Усилиями генетиков были открыты закономерности наследования фенотипических признаков, сформулирована хромосомная теория наследственности, разработан Вавиловский закон параллельной изменчивости признаков, доказано, что носителями наследственности являются нуклеиновые кислоты, разработаны теоретические положения повышения продуктивности при производстве антибиотиков, селекции сельскохозяйственных и лесных растений и животных, начаты исследования по изучению популяций организмов. Только краткое перечисление важнейших достижений этой науки заняло бы не одну страницу, написанную петитом. Одним из важнейших ее инновационных достижений является генетическая инженерия. Термин генетическая инженерия появился на рубеже 70-х годов двадцатого века. В то время впервые был выделен in vitro «чистый» ген (лактозный оперон кишечной палочки) и химическим путем был синтезирован ген аланиновой тРНК дрожжей. К этому времени эмбриологи достигли значительных успехов в манипулировании зародышевыми клетками животных. У лягушки удаляли ядро из яйцеклетки и вводили ядро кишечной стенки головастика. При этом получали нормальный взрослый организм. Так впервые неполовым путем было воспроизведено животное. Это достижение позволило клонировать особи, то есть получать их генетически идентичные копии.
Все это позволило заменять определенные дефектные гены полноценными, то есть осуществлять генную терапию. Именно для этого процесса первоначально был введен термин «генетическая инженерия». Однако вскоре стало ясно, что с появлением «чистых» генов открывается перспектива конструирования бактерий с несвойственными им признаками, в том числе и высокоэффективных штаммов промышленных организмов. Поэтому генетической инженерией стали называть комплекс молекулярно-генетических методов, с помощью которых можно осуществлять целенаправленное конструирование организмов путем различных операций над информационными молекулами (В. Н. Рыбчин, 1999).
Особые успехи генетической инженерии связаны с так называемой векторной трансформацией. В основе этого подхода лежит использование векторных молекул, или векторов, в качестве которых применяли плазмиды. Векторы - это молекулы ДНК, способные переносить включенные в них гены в клетку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом. Плазмиды - это внехромосомные факторы наследственности, генетические элементы, способные стабильно существовать в клетке в автономном, не связанном с хромосомным состоянием. Термин «плазмиды» предложил Дж. Ледерберг и др. в 1952 году. Плазмиду, способную объединяться с хромососмой, называют эписомой. К плазмидам относят генетический аппарат клеточных органоидов (митохондрий, пластид), а также группы сцепления, не являющиеся жизненно важными для содержащих их клеток. Наиболее изучены бактериальные плазмиды (фактор фертильности - F-фактор), колициногенные (колицины-антибиотики) факторы (Col-факторы), факторы устойчивости к лекарственным веществам (R-фактор), профаги и многие другие.
Многие плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочные молекулы ДНК. Они широко распро-странены в живых клетках (в том числе и высших организмов) и интенсивно используются в генной инженерии в качестве основных компонентов разнообразных молекулярных переносчиков чужеродной ДНК. В 70-е годы выяснилось, что причиной опухолеобра-зования являются так называемые Ti-плазмиды (Ti-tumor inducing, англ., индуцирующая опухоль). Они были обнаружены в клетках некоторых штаммов A. tumefaciens. Ti-плазмиды - это кольцевые молекулы ДНК (размером 50-80 мкм с молекулярной массой около 1,3х108 Дальтон и длиной от 140 до 250 тыс. пар нуклеотидов). Эти плазмиды проникают из бактерий в клетки растения, и часть ДНК Ti-плазмиды, так называемая Т-ДНК вызывает:
1) образование опухоли,
2) гиперпродукцию фитогормонов: цитокининов и индолилуксусной кислоты (ауксина),
3) синтез ряда производных аминокислот, объединяемых под общим названием опины.
Oпухоль возникает вследствие нарушения баланса фитогормонов, от которого зависит нормальный морфогенез растения. Опины, выделяемые клетками опухоли, бактерия использует в качестве источников углерода и азота, причем только в том случае, когда A. tumefaciens содержит Ti-плазмиду, заразившую клетки растения (С. Г. Инге-Вечтомов, 2009).
В настоящее время выделены и проклонированы несколько десятков генов высших растений, в том числе гены, контролирующие запасные белки: сои, ячменя, гороха, кукурузы, а также некоторые гены, контролирующие активность ферментов. На базе Ti-плазмид были созданы векторы, способные интегрироваться в растительные хромосомы. Это дало возможность вводить в клетки растений чужеродные гены и получать из единственной клетки сформировавшееся растение. Такие организмы, в которых чужеродные гены обнаруживаются во всех его клетках, включая половые, называются трансгенными. Они обладают свойством передавать приданные им новые признаки своему потомству. В последние десятилетия трансгенные организмы были получены не только у растений, но и у животных организмов.
Трансгенез (в некоторых публикациях трансгеноз) - это процесс внесения в геном хозяина новой для него конструкции (трансгена).
Первыми чужеродными генами, введенными в начале 80-х годов в высшие растения, были гены устойчивости к антибиотикам из Е. coli. В клетки подсолнечника с помощью Ti-плазмид был передан ген фазеолина бобов. Фазеолин - это гликопротеин, составляющий до 50 % запасного белка бобов. Будущее растение названо санбин [санбин = sunflower (подсолнечник) + bean (бобы)]. Получены растения табака, которые светятся в темноте благодаря экспрессии в них гена люциферазы светлячка. В Центральном НИИ лесной генетики и селекции (г. Воронеж) с конца 80-х годов начаты первые опыты по генетической инженерии с лесными древесными растениями. Однако в последние годы эти исследования, к сожалению, были прекращены.
В целом же получение трансгенных растений идет по нарастающей тенденции. Они уже вышли за пределы лабораторий. В 1994 году впервые на рынке появились томаты, которые остаются твердыми многие недели после их сбора. Прошли полевые испытания устойчивые к гербицидам растения: табак, хлопок, картофель, помидоры, кукуруза, свекла, рапс, салат-латук и др.
Однако остаются вопросы их экологической устойчивости и влияния на окружающую среду, а в некоторых случаях и на их потребителей. Эти проблемы время от времени ставятся в повестку дня и разрабатываются специальные мероприятия по изучению и предотвращению возможных вредных последствий от выведения и использования трансгенных растений. Однако для объективных оценок потребуются многие годы скрупулезных научных исследований. Кроме работ по созданию и исследованию трансгенных растений проводятся аналогичные работы с животными. Цели при этом ставились разные: от изучения самой возможности создания трансгенных животных до животных, с нужными человеку свойствами или имеющих определенные возможности для создания необходимых биопрепаратов. Объем рынка трансгенных животных оценивается в миллиарды долларов (В. И. Глазко, Г. В. Глазко, 2008).
Одной из проблем является создание животных с пониженным содержанием лактозы. Большая часть взрослых людей неспособна переваривать молочный сахар - лактозу, поэтому требуются животные с низким содержанием лактозы в молоке. Во Франции была создана трансгенная мышь, в молоке которой содержание лактозы снизилось на 50 %, в то время как содержание других веществ (жира, белков, минеральных компонентов) не отличалось от контроля. Проводятся также опыты по увеличению скорости роста и массы у свиней и мышей.