Статья: Морфофункциональные изменения органов иммунной системы крыс при длительном воздействии низких доз ДДТ

В сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью коммерческих наборов определяли концентрации ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-12, TФР-в (“Bender Medsystems”, Австрия), неоптерина и кортикостерона (“IBL”, Германия).

Статистическую обработку проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA (“Statsoft Inc.”, США). Анализировали соответствие вида распределения признака закону нормального распределения с использованием критериев Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса, Шапиро-Уилка. Центральные тенденции и рассеяния количественных признаков, имеющих приближенно нормальное распределение, описывали средним значением М и стандартной ошибкой среднего значения m. Независимые группы сравнивали по количественному признаку с помощью t-критерия Стьюдента с учетом значений критерия Левена о равенстве дисперсий, критерия Манна-Уитни, ч2. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Морфофункциональные изменения тимуса при воздействии низких доз ДДТ

При изучении гистологических препаратов тимуса крыс всех опытных групп, в первую очередь, была отмечена гибель тимоцитов, проявляющаяся наличием участков опустошения коркового вещества, появлением картины «звездного неба». Данные признаки усиливались с увеличением среднесуточной потребленной дозы ДДТ и длительности потребления. Известно, что гибель клеток тимуса в процессах негативной селекции происходит, в основном, за счет апоптоза. По данным работ О. Tebourbi с соавт., 1998 воздействие больших доз ДДТ инициирует гибель тимоцитов также путем апоптоза. При этом имеют место два механизма апоптоза тимоцитов - р53-зависимый и р53-независимый пути (Ярилин А.А., 1996). р53-независимый путь индуцируется гормонами надпочечников - глюкокортикоидами. В связи с этим, для установления механизмов запуска апоптоза тимоцитов при действии на них низких доз ДДТ, было проведено определение концентрации кортикостерона в сыворотке крови, являющегося основным глюкокортикоидом у крыс. Еще в 60-х гг. прошлого века было установлено, что производные ДДТ в больших дозах оказывают цитостатическое действие на клетки карциномы надпочечников и соответственно, снижают продукцию глюкокортикоидов (Hoffman D. et al., 1972). В 70-е гг. препараты на основе ДДТ применялись в химиотерапии карциномы надпочечников, и в настоящее время продолжаются разработки новых цитостатических препаратов на основе ДДТ (Asp V. et al., 2010). Но механизм действия ДДТ остается до сих пор невыясненным. В нашем исследовании, во всех опытных группах отмечено снижение уровня кортикостерона по сравнению с контрольными значениями. Этот факт позволяет утверждать, что в тимусе крыс под действием ДДТ, задействован в основном р53-зависимый, а не глюкокортикоид-индуцируемый р53-независимый путь апопотоза.

Потребление ДДТ крысами в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут в течение 6 недель, приводило к морфофункциональным изменениям тимуса, обусловленным гибелью как лимфоцитов, так и ретикулярных эпителиоцитов. Гибель лимфоцитов подтверждало двукратное увеличение по сравнению с контрольной группой процентного содержания клеток, экспрессирующих белок р53 (рис.1). р53-позитивные клетки располагались диффузно в корковом веществе, а также встречались и в мозговом веществе, то есть апоптозу подвергались как дифференцирующиеся, так и дифференцированные тимоциты. Наблюдали увеличение количества тимических телец в мозговом веществе (табл.1). Таким образом, ДДТ даже в самой низкой исследованной дозе, способен усиливать гибель клеток в тимусе. Гибель клеток вызывала реактивное усиление пролиферации тимоцитов. Было отмечено статистически значимое усиление пролиферации ex tempore тимоцитов по сравнению с контрольной группой, при этом пролиферативный ответ на введение митогена не снижался (рис.2) и расширение субкапсулярного слоя, не достигшее, однако, статистически значимых отличий от контрольной группы.

В группе, потреблявшей ДДТ в дозе 7,77±0,17мкг/кг/сут в течение 6 недель, по сравнению с группой, потреблявшей меньшую дозу ДДТ, принципиальных изменений гистологического строения тимуса не было. Как и в группе крыс, потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут, отмечалась гибель лимфоцитов в корковом веществе. Значительное усиление апоптоза клеток, отмеченное в группе, потреблявшей меньшую дозу ДДТ в течение того же срока исследования, дает возможность предположить, что в данной, более высокой, дозе ДДТ, массовая гибель клеток могла наблюдаться ранее, что и привело к сужению субкапсулярного слоя по сравнению со значением опытной группы, получавшей меньшую дозу ДДТ. Доля клеток, экспрессирующих белок р53, превышала значения контрольной группы, но была меньше, чем в группе крыс (рис.1), потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут в течение аналогичного срока. р53-позитивные клетки располагались в основном на границе коркового и мозгового вещества. При этом соотношение коркового и мозгового веществ не изменялось.Однако структура мозгового вещества тимуса имела ряд отличий, связанных с усилением гибели ретикулярных эпителиоцитов. Эти процессы были выражены в увеличении количества тимических телец и ретикулярных эпителиоцитов в их составе как в сравнении с контрольной группой, так и с группой, потреблявшей ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут в течение 6 недель (табл.1). Все эти изменения привели к реактивному усилению пролиферативной активности тимоцитов как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с предыдущей опытной группой, больше, чем в три раза (рис.2). Также было отмечено значительное повышение пролиферации клеток в ответ на введение митогена.

В тимусе крыс контрольной группы через 10 недель после начала эксперимента в сравнении с тимусом контрольной группы предыдущего срока исследования, было отмечено усиление гибели ретикулярных эпителиоцитов, выражавшееся в статистически значимом увеличении количества тимических телец в мм2 среза мозгового вещества, а также изменении соотношения стадий развития тимических телец в сторону увеличения доли телец в начальной стадии. Отмечалось также усиление гибели лимфоцитов. Экспрессия белка р53 клетками тимуса увеличилась более чем в два раза (рис.1). р53-позитивные клетки располагались в основном субкапсулярно. В корковом веществе были выявлены участки гибели лимфоцитов, появление картины «звездного неба». Это свидетельствует о развитии начальной стадии возрастной инволюции тимуса у крыс данного возраста (Shanley D.P. et al., 2009). Известно, что тимус достигает максимума развития к периоду полового созревания, затем начинается возрастные изменения, появляющиеся усилением гибели лимфоцитов, увеличением образования тимических телец, увеличением числа клеток в тимических тельцах, что в конечном итоге приводит к сморщиванию долек (Greenstein B.D. et al., 1986; French R.A. et al., 2002; Ярилин А.А., 2003).

Рис. 1. Процентное содержание клеток тимуса, экспрессирующих белок р53, в контрольных группах через 6 и 10 недель после начала эксперимента, и в опытных группах, потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/к/сутг и 7,77±0,17мкг/кг/сут в течение 6 и 10 недель. Статистически значимое отличие: * - от контрольной группы; # - от группы, потреблявшей меньшую дозу ДДТ.

Рис. 2. Пролиферация ex tempore и индекс пролиферации клеток тимуса контрольной и опытных групп через 6 недель после начала эксперимента. Статистически значимое отличие: * - от контрольной группы; # - от группы, потреблявшей меньшую дозу ДДТ.

После 10 недель потребления ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут, гибель ретикулярных эпителиоцитов в мозговом слое была более выражена, чем в контрольной группе за счет увеличения количества клеток, образующих тимические тельца (табл.1). Однако, процентное содержание клеток, экспрессирующих белок р53, не изменилось по сравнению с контрольной группой (рис.1). В отличие от контрольной группы, где р53-позитивные клетки располагались в основном субкапсулярно, в группе крыс, потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут в течение 10 недель, клетки, экспрессирующие белок р53, располагались диффузно в корковом и в виде скоплений в мозговом веществе. Соотношение коркового и мозгового вещества не изменялось и не отличалось от значений контрольной группы. Тем не менее, отмечалось прогредиентное снижение ширины субкапсулярного слоя, в результате чего, этот показатель был ниже, чем в контрольной группе. Наиболее вероятной причиной этого была наблюдавшаяся значительная гибель лимфобластов на более раннем сроке исследования данной дозы ДДТ, а также снижение пролиферативной активности тимоцитов в данной опытной группы, что не дало возможности восстановить численность клеток в субкапсулярном слое. Стоит также отметить, что в данной дозе исследования значительно увеличилась пролиферация тимоцитов в ответ на введение митогена (рис.3).

В тимусе крыс, потреблявших ДДТ в течение 10 недель в дозе 7,77±0,17мкг/кг/сут, отмечено усиление гибели лимфоцитов. Экспрессия белка р53 клетками тимуса возросла по сравнению с контрольной и опытной группой аналогичного срока исследования, потреблявшей меньшую дозу ДДТ (рис.1). р53-позитивные тимоциты обнаруживались в корковом и мозговом веществе, а также отмечалось увеличение их количества в субкапсулярном слое, что вместе со значительным снижением пролиферативной активности в данной группе, привело к снижению толщины слоя лимфобластов. Значительные изменения отмечались также и в строме тимуса. Увеличилось количество гибнущих ретикулярных эпителиоцитов за счет увеличения как числа тимических телец, так и количества клеток в них. При этом только в данной опытной группе, были выявлены тимические тельца 3-й стадии развития (табл.1). Значительная гибель ретикулярных эпителиоцитов привела к уменьшению доли мозгового вещества в тимусе крыс данной группы.

Сравнение изменений в группах показало, что их характер одинаков в контрольных и опытных группах, но темпы гибели клеток тимуса при потреблении ДДТ были ускорены. В опытной группе через 6 недель после начала эксперимента изменения были сходны с показателями контрольной группы через 10 недель. Поскольку в контрольной группе более длительного срока исследования наблюдались возрастные изменения тимуса, то схожесть показателей может свидетельствовать о более быстром течении этих процессов у крыс, получавших низкие дозы ДДТ в течение 6 недель. При этом данные изменения не носят адаптивный характер, т.к. известно, что в начальные сроки краткосрочной адаптации, любые, даже кратковременные стиму-лы, вызыва-ют стимуляцию коры надпочечников (Селье Г., 1960; Ткаченко Б.И., 1994). Однако, изучение концентрации кортикостерона в нашем исследовании, показало снижение его уровня во всех опытных группах. При долговременной адаптации (Меерсон Ф.З., 1981) во всех органах, ответственных за нее, появляются новые специфические изменения, обеспечивающие приспособление к новым условиям существования. Появления данных изменений в нашем исследовании также отмечено не было.

После потребления ДДТ в течение 10 недель выявленные изменения в тимусе усилились в сравнении с предыдущим сроком исследования и контрольной группой. Но характер изменений также был идентичен у сравниваемых групп, за исключением того, что тимоциты крыс, потреблявших ДДТ в течение 10 недель в меньшей дозе приобрели свойство реагировать на митоген резким усилением пролиферации на фоне пониженной пролиферативной активности. Выраженная гибель ретикулярных эпителиоцитов, наблюдаемая как через 6, так и через 10 недель в опытной группе,

Таблица. 1

Морфометрические показатели тимуса крыс, потреблявших ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг/сут и 7,77±0,17мкг/кг/сут в течение 6 и 10 недель и крыс контрольных групп (М±m)

Примечание:

Статистически значимое отличие: * - от контрольной группы; # - от группы, потреблявшей меньшую дозу ДДТ; ^ - от группы меньшего срока исследования.

указывает на возможное нарушение секреции тимических гормонов и созревания Т-лимфоцитов. Это усиление инволютивных изменений может говорить о негативном влиянии малых доз ДДТ на функционирование тимуса, а, следовательно, и быть причиной нарушения реакций в первую очередь клеточного иммунитета также как и при действии субтоксических доз ДДТ (Banerjee B.D., 1987; Udoji F. et al., 2010).

Рис. 3. Пролиферация ex tempore и индекс пролиферации клеток тимуса контрольной и опытных групп через 10 недель после начала эксперимента. Статистически значимое отличие: * - от контрольной группы; # - от группы, потреблявшей меньшую дозу ДДТ.