АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Морфофункциональные изменения органов иммунной системы крыс при длительном воздействии низких доз ДДТ
03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология
Тимохина Екатерина
Москва - 2015
Работа выполнена в ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН
Научный руководитель:
доктор медицинских наук Яглова Наталья Валентиновна
Официальные оппоненты:
Профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор Торбек Виктория Эдуардовна
Профессор кафедры морфологии и ветеринарии ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет - Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязевa, доктор биологических наук, профессор митоген тимоцит пестицид
Панов Валерий Петрович
Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1)
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В последние десятилетия в мире отмечается рост заболеваемости, связанный с нарушениями функционирования иммунной системы. Многие исследователи из разных стран сходятся во мнении, что основной причиной повышения числа заболеваний можно по праву считать загрязнение окружающей среды, приводящее к срыву защитных функций и адаптационных резервов организма человека (Гичев Ю.П., 1995; Cooper G., et al., 2004; Karmaus W., et al., 2005; Udoji F., et al., 2010; Brauner E., et al., 2012). Одними из наиболее опасных веществ, поступающих в окружающую среду в результате деятельности человека, являются стойкие органические загрязнители (СОЗ) в силу их высокой токсичности, стабильности, способности к дальнему переносу и биоаккумуляции. Наиболее распространенным СОЗ, широко применявшимся в очень больших количествах в 50-70гг. (более 4,5 млн. тонн) в сельском, домашнем хозяйстве, на производстве и в воинских частях, считается пестицид 1,1,1-трихлор-2,2-бис(4-хлорфенил)этан (ДДТ). На сегодняшний день, во всем мире ежегодно используется 4000 - 5000 тонн ДДТ для борьбы с малярией и висцеральным лейшманиозом (Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, 2010). Благодаря высокой устойчивости к разложению фоновые дозы ДДТ регистрируются на всех материках и во всех океанах (Bachman M.J. et al., 2014; Bouwman H. et al., 2014; Velasco A. et al., 2014). Высокая растворимость в жирах и низкая растворимость в воде обусловливают накопление ДДТ в жировой ткани. Организмы более высоких трофических уровней имеют тенденцию к депонированию больших количеств ДДТ по сравнению с организмами низших уровней. В настоящее время на планете не существует организма, который не содержал бы в своих тканях ДДТ и его метаболитов.
По данным различных исследований, ДДТ и его метаболиты обладают канцерогенным действием (Tomatis L. et al., 1975; Jin X., et al., 2014), а также являются эндокринными дизрапторами, способными приводить к развитию эндокринных заболеваний, а также нарушать физиологическое течение беременности и приводить к преждевременным родам и выкидышам (Venners S.A. et al., 2005; Codru N. et al., 2007; Cox Sh. et al., 2007; Jones O.A. et al., 2008; Sadasivaiah Sh. et al., 2008; Turyk M., 2009). В токсичных и субтоксичных дозах ДДТ и его метаболиты оказывают иммуносупрессивное действие, подавляя гуморальный и клеточный ответ (Banerjee B.D. 1987; Tebourbi O., et al., 1998; Забродский П. Ф. 2007) и др.
Однако крайне мало работ, посвященных изучению влияния низких фоновых доз ДДТ, предусмотренных максимальными допустимыми уровнями (МДУ) содержания в пищевых продуктах, водопроводной воде и т.д. Данные о влиянии ДДТ на функционирование иммунной системы характеризуются фрагментарностью и противоречивостью. По данным Daniel V., et al., 2002; Ndebele K., et al., 2004 при фоновом воздействии ДДТ отмечается снижение секреции Th1 цитокинов (ИЛ-2, интерферона-г), увеличение Th2 цитокинов, в основном ИЛ-4, уменьшение активности натуральных киллеров, а также повышение синтеза IgE, G, A. По другим данным, наблюдается усиление факторов клеточного иммунитета - секреции Th1 цитокинов интерлейкинов (ИЛ)-1,-2, фактора некроза опухоли-б, а также повышение активности индуцибельной NO-синтазы, активности макрофагов (Kim J., et al., 2004; Dutta R., et al., 2008). Практически полностью отсутствуют сведения об изменениях иммунного статуса под влиянием низких доз ДДТ.
Цель исследования: изучение морфофункциональных изменений органов иммунной системы крыс при длительном воздействии низких доз ДДТ.
Задачи исследования:
Изучить морфофункциональные изменения тимуса крыс при длительном воздействии низких доз ДДТ;
Исследовать механизмы гибели тимоцитов под действием низких доз ДДТ;
Изучить морфофункциональные изменения селезенки крыс при длительном воздействии низких доз ДДТ;
Изучить изменения пролиферативной активности ex tempore и пролиферативного ответа на введение митогена при длительном воздействии низких доз ДДТ;
Оценить изменения цитокинового профиля сыворотки крови крыс при длительном воздействии низких доз ДДТ.
Научная новизна:
Впервые установлено, что воздействие низких доз ДДТ, предусмотренных максимальными допустимыми уровнями его содержания в продуктах питания, приводит к развитию морфофункциональных изменений органов иммунной системы.
Впервые охарактеризованы морфологические и функциональные изменения тимуса, селезенки при различном по длительности воздействии низких доз ДДТ, заключающиеся в гибели клеток лимфоидного происхождения, в том числе Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, что вначале вызывает усиление их пролиферации, а затем приводит к значительному снижению пролиферативной активности. Установлено, что в механизмах гибели тимоцитов под действием низких доз ДДТ задействован р53-зависимый путь апоптоза.
Впервые выявлено, что воздействие низких доз ДДТ приводит к изменениям цитокинового профиля, коррелирующим с морфофункциональными изменениями тимуса и селезенки, но не вызывает стойкого сдвига в балансе Th1-Th2 цитокинов.
Практическая значимость:
Выявленные морфофункциональные изменения органов иммунной системы крыс при длительном воздействии низких доз ДДТ показывают, что максимальные допустимые уровни его содержания в продуктах питания не являются безопасными для организма. Эти данные могут стать основой для дальнейших исследований по установлению безопасных уровней содержания ДДТ и его метаболитов в продуктах питания.
Внедрение результатов исследования: Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре анатомии и гистологии животных им. А.Ф.Климова ГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина.
Положения, выносимые на защиту:
Длительное воздействие низких доз ДДТ, предусмотренных МДУ его содержания в продуктах питания, приводит к развитию морфофункциональных изменений центральных и периферических органов иммунной системы крыс, обусловленных гибелью клеток лимфоидного происхождения, реактивным усилением, а затем снижением их пролиферативной активности.
Воздействие низких доз ДДТ приводит к изменениям цитокинового профиля, коррелирующим с морфофункциональными изменениями тимуса и селезенки, но не вызывает стойкого сдвига в балансе Th1-Th2 цитокинов.
Апробация работы: Материалы диссертации доложены и обсуждены на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г.Москва, 2012г.), конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (г.Москва, 2012г.), ХХ международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (г.Ялта, Украина, 2012г.), VII Международном конгрессе по интегративной антропологии (г.Винница, Украина, 2013г.), конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (г.Москва, 2014г.), конференции «Окружающая среда и здоровье. Здоровая среда - здоровое наследие» (г.Москва, 2014г.), межлабораторной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (июнь 2014г.).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на 121 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 64 рисунками и 7 таблицами. Список литературы включает 145 источников, из них 49 отечественных и 96 зарубежных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперимент выполнен на самцах крыс Вистар (n=64) с массой тела 80-100гг (питомник «Столбовая»). Животные содержались в виварии, уход за ними осуществлялся по нормам и правилам обращения с лабораторными животными, в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), правилами лабораторной практики в Российской федерации (приказ МЗ РФ от 19.06.2003 №267) и законом «О защите животных от жестокого обращения» гл. V, ст. 10, 4679-ГД от 01.12.1999г. Эксперимент проведен в соответствии с правилами работы с использованием экспериментальных животных, утвержденными приказом Минздрава СССР № 577 от 12.08.1977г. и одобрен этическим комитетом НИИ морфологии человека РАМН (протокол №8а от 06.10.2011г.). Животных рандомизировали на 6 групп: 2 контрольные и 4 опытные. Доступ к воде и пище у крыс был свободным. Животные опытных групп (n=44) вместо воды получали растворы о,п-ДДТ (“Sigma”, США) с концентрацией 20 и 80мкг/л. Учет потребляемой жидкости производили ежедневно. Выбор потребляемой дозы ДДТ производили с учетом требований National Toxicology Program (США) к определению низких доз, с учетом пороговых значений низких доз для ДДТ (50 мкг/кг/сут) (Vandenberg L.N. et al., 2012) и нормативам содержания ДДТ в продуктах питания в Российской Федерации (СанПин 2.3.2.1078-01. - 2008). Животные контрольных групп (n=20) получали водопроводную воду ad libitum. Среднесуточное потребление ДДТ крысами составило 1,89±0,086мкг/кг в группе, получавшей раствор ДДТ 20мкг/л, и 7,77±0,17мкг/кг в группе, получавшей раствор 80мкг/л. Предварительно было подтверждено отсутствие в водопроводной воде и корме для лабораторных животных ДДТ, его метаболитов и родственных хлорорганических соединений. Исследование образцов проведено методом газожидкостной хроматографии в ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве».
Животных выводили из эксперимента через 6 и 10 нед. с помощью передозировки золетила (“Virbac Sante Animale”, Франция), вводимого внутримышечно в дозе 50мг/кг. Кусочки тимуса и селезенки фиксировали в растворе Буэна. После стандартной гистологической проводки с помощью гистопроцессора «Tissue-Tek VIP 5 Jr» («Hygeco», Франция) кусочки органов заливали в парафин. Срезы изготавливали с помощью микротома «Microm HM 340E» («Microm Gmbh», Германия) и окрашивали гематоксилином и эозином. Изучение гистологических препаратов проводили методом световой микроскопии с использованием микроскопа “Leica DM2500” и компьютерной морфометрии с помощью программы “ImageScope” (“Leica Microsystems, GMBH, Австрия).
В гистологических препаратах тимуса определяли соотношение коркового и мозгового веществ, ширину субкапсулярного слоя, количество тимических телец в мм2 площади среза мозгового вещества, оценивали количество ретикулярных эпителиоцитов, входящих в их состав, и стадии развития телец (1-я стадия - сближение нескольких ретикулярных эпителиоцитов с повышенной оксифилией цитоплазмы; 2-я стадия - концентрическое наслоение ретикулярных эпителиоцитов и накопление в них кератина; 3-я стадия - формирование полости в центре тельца; 4-я стадия - распад тимического тельца).
В гистологических препаратах селезенки определяли соотношение белой и красной пульпы, в белой пульпе - соотношение площади лимфатических узелков и периартериальных лимфоидных муфт (ПАЛМ), диаметр лимфатических узелков и их герминативных центров, ширину маргинальной и мантийной зон, количество лейкоцитов в маргинальной зоне в мм2 площади среза. Подсчитывали количество узелков в мм2 площади среза селезенки, долю узелков с опустошением герминативных центров. В красной пульпе определяли количество мегакариоцитов и лейкоцитов в мм2 площади среза.
Иммуногистохимическое исследование экспрессии белка р53 тимоцитами выполняли с использованием первичных кроличьих поликлональных антител (“Santa Cruz Biotechnology”, США). Визуализацию реакции осуществляли с помощью набора реактивов “UltraVision Detection System” (“Termo Scientific”, США). Препараты докрашивали гематоксилином Майера. Процент р53-позитивных клеток рассчитывали с помощью программы “ImageScope” (“Leica Microsystems, GMBH, Австрия).
Определяли пролиферативную активность клеток тимуса и селезенки крыс ex tempore (Рахмилевич А.Л. и др., 1990; Яглова Н. В. И др., 2013.). Отмытые клетки в количестве 2х105 вносили в 96-луночные планшеты для определения 4-х часовой пролиферации, добавляли 3Н-тимидин (1мкКи/лунку). После инкубации клетки снимали на харвестре, метку просчитывали на в-счетчике (“LKB” Швеция). Также определяли пролиферативную активность лимфоцитов тимуса и селезенки в реакции бласттрансформации. В лунки планшета вносили смесь 100 мкл клеток селезёнки или тимуса в концентрации 2х106 клеток/мл и 50 мкл митогена Конканавалина А (“Sigma”, США). Контрольные лунки содержали смесь клеток и среду для культивирования. Планшет инкубировали 72 ч при 37оС в атмосфере воздуха с 5% содержанием СО2. За 4 часа до окончания инкубирования в лунки вносили по 1 мкКи 3Н-тимидина. Индекс стимуляции пролиферации в реакции бласттрансформации (ИБ) определяли по формуле: ИБ= А/В, где А - Конканавалин А-стимулированная пролиферация клеток, В - пролиферация клеток в среде.