Статья: Модуляция уровня miR-204-5p индуцирует формирование преметастатической ниши в модели меланомы В16 in vivo

Для контроля качества, статистического анализа и аннотирования микроРНК использовали программное обеспечение Expression Console и Transcriptome Analysis Console 2.0 Soft-Ware (Build 1.4.0.3.8) (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Данные были автоматически статистически проанализированы с использованием теста ANOVA и FDR-скорректированных значений. Различия в экспрессии микроР- НК оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни и считали значимыми при р <0,05. Иерархическая кластеризация уровней экспрессии микроРНК была сформирована с помощью программного обеспечения Transcriptome Analysis Console 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Данные ПЦР в реальном времени были проанализированы методу AACt и непараметрическому U-критерий Манна-Уитни с использованием программы Statistica 6.1 (StatSoft, Москва, Россия).

Анализ сигнальных путей, регулируемых наиболее измененными микроРНК в образцах ткани почек экспериментальной группы по сравнению с контрольной группой, осуществляли при помощи программного обеспечения DIANA miRPath v. 3.0 на основе базы данных KEGG (с применением баз данных TargetScan v.7.0, TarBase, microT-CDS). Определение генов мишеней mmu-miR-26a-5p, производилось по трем биоинформатическим базам данных (TargetScan, MIRDB, MiRTarBase).

Результаты и обсуждение

микрорнк метастазирование сигнальный механизм канцерогенез

Исследование экспрессии miR-204-5p в ткани печени, лёгких и почек экспериментальных животных показало увеличение экспрессии miR-204-5p в ткани почек в экспериментальной группе в 9 раз по сравнению с контролем (p = 0,01). В ткани печени отмечалась тенденция к увеличению уровня miR-204-5p (p = 0,06). На основании полученных данных на следующем этапе исследования было проведено определение экспрессионного профиля микроРНК в ткани почек у животных в экспериментальной и контрольной группах.

По результатам микрочипирования в ткани почек экспериментальных животных, после введения синтетического аналога (имитатора) шШ-204-5р, по сравнению с группой контроля, было выявлено изменение уровня 12 микроРНК. При этом 9 микроРНК имели пониженный уровень экспрессии в ткани почек после введения мимика шШ-204-5р, тогда как 4 микроРНК были повышены, но менее чем в 2 раза. При иерархической кластеризации результатов микрочипирования (рис. 1, 2) наблюдалось четкое разделение образцов экспериментальной и контрольной групп на два класса. Наиболее значимые изменения между экспериментальной группой после введения имитатора шЖ-204-5р и контрольной группой наблюдались в микроРНК, определенных в таблице 1. Следует отметить, что все микроРНК, которые были изменены в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой более чем в 2 раза, демонстрировали снижение экспрессии в группе животных после введения имитатора miR-204-5p. Наиболее выраженное снижение экспрессии микроРНК в 3,7 раза в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой наблюдалось для miR-26a-5p, что способствовало выбору данной микроРНК для дальнейшего исследования. Целью дальнейшего биоинформатичекого анализа была оценка возможных механизмов модулирующего эффекта miR-204-5p на экспрессию miR-26a-5p.

Рисунок 1. Результаты профилирования микроРНК почек экспериментальной группы животных (обозначены цифрой 1) и контрольной группы (обозначены цифрой 2). Цвет кластера от серого до черного отражает относительный уровень экспрессии ми- кроРНК в соответствии с цветовым ключом

Figure 1. Results of microRNA profiling of kidneys from experimental group of animals (indicated by number 1) and the check group (indicated by number 2). Cluster color, varying from gray to black, reflects the relative level of miRNA expression in accordance with the key color

Рисунок 2. Диаграмма разброса уровня экспрессии микроРНК образцов ткани почек экспериментальной группы животных и контрольной. Сверху от разделительной линии обозначены уровни микроРНК с повышенной экспрессией в экспериментальной группой по сравнению с контролем. Снизу от разделительной линии - обозначены уровни микроРНК с повышенной экспрессией в экспериментальной группой по сравнению с контролем

Figure 2. Diagram of miRNA expression level of kidney tissue samples from experimental animal group and a check one. Above the dividing line are microRNA levels with increased expression in experimental group compared with the check one. Below the dividing line are miRNAs levels with increased expression in experimental group compared to the check one.

Таблица 1 / Table 1

Уровни экспрессии микроРНК тканей почек мышей линии C57Bl6 с экспериментальной меланомой B16 после введения имитатора miR-204-5p и контрольной группы по данным микрочипирования / miRNAs expression levels of kidney tissue in C57Bl6 mice line experimental B16 melanoma after administration of miR-204-5p simulator and in check group according to microchip data

Примечание: * отрицательное значение показателя - пониженный уровень микроРНК в группе модуляции miR-204-5p, p - различия считались статистически значимыми при значении показателя <0,05.

Note: * a negative value of the indicator is a reduced level of microRNA in the miR-204-5p modulation group, p- differences were considered statistically significant with a value of <0.05.

Определены 47 механизмов передачи сигнала посредством биоинформационного анализа как измененные в образцах ткани почек экспериментальной группы по сравнению с контрольной группой. Сигнальные механизмы представлены в таблице 2. Механизмы передачи сигнала, регулируемые микроРНК с наиболее высоким уровнем изменений, включали сигнальные пути мито- генактивируемых протеинкиназ (МАРК), протеогликанов при почечно-клеточном раке, клеточной адгезии, деградации лизина, процессы регуляции реабсорбции кальция и синтеза различных видов гормонов (табл. 2).

Таблица 2 / Table 2

Механизмы передачи сигнала, регулируемые микроРНК с наиболее высоким уровнем изменений (представлено 15 наиболее статистически высокозначимых сигнальных механизма) / Signal transmission mechanisms regulated by miRNAs with the highest change level (15 of most statistically important signaling mechanisms are presented)

Примечание: p - различия считались статистически значимыми при значении показателя <0,05.

Note: p- differences were considered statistically significant with a value of <0.05.

Биоинформатический анализ генов-мишеней и сигнальных каскадов, регулируемых максимально сниженной микроРНК - miR-26a-5p, выявил у нее 42 гена-мишени. Гены-мишени для микроРНК определялись на основе следующих информационных баз: TargetScan, MIRDB, MiRTarBase. Для дальнейшего исследования были использованы гены (рис. 3), являющиеся мишенями для данной микроРНК на основе трех вышеуказанных баз данных. Полученные гены-мишени, регулируются измененными в экспериментальной группе микроРНК. Гены-мишени miR26a-5p включали: Dmxll, Nudtll, Strbp, Kcnj2, Stradb, Rgs17, Ppp3r1, Trp53inp1, Ccnj, Tmem184b, Map2, Pten, Fa2h, Nus1, Elavl2, Ctsl, Patz1, Tob1, Msantd1, Tbc1d30, Slc2a13, Acsl3, Slc38a2, Ezh2, Mdn1, Acbd5, Atf2, Trpc3, Mtx2, Crebzf, Dock4, Slc19a2, Rhoq, Sema6d, Tmem263, Capn10, Arhgef26, Osbpl2, Zdhhc6, Ndfip2, Ddx17, Mat2a. Функциональная роль генов-мишеней miR-26a-5p связана с 64 биологическими процессами, включающими апоптоз, клеточную пролиферацию, ангиогенез, ответ на окислительный стресс, метаболизм пирувата, сигнальные каскады MAPK, RAS, p53.

Рисунок 3. Диаграмма Эйлера-Венна генов-мишеней микроРНК miR-26a-5p, которые были определены по трем биоинфор- матическим базам данных (TargetScan, MIRDB, MiRTarBase)

Figure 3. Euler/Venn diagram of miR-26a-5p miRNA target genes, which were determined using three bioinformatics databases (Target Scan, MIRDB, MiRTarBase)

Применение антисмысловых олигонуклеотидов обладает потенциальной терапевтической значимостью для лечения различных заболеваний. Данный фармакологический эффект связан с модулированием экспрессионной активности различных микроРНК и дальнейшим изменением содержания в клетках их генов-мишеней, которые в свою очередь могут отвечать за реализацию таких биологических процессов как: пролиферация, инвазия, ангиогенез, влияющих на опухолевую прогрессию.

В этой связи нами было выполнено экспериментальное исследование на основе модуляциями уровня микроРНК miR-204-5p в меланоме B16 in vivo. Выявлено, что при введении антисмысловых нуклеотидов, их повышенная концентрация, а значит и предполагаемые эффекты, наблюдаются в ткани почек. В этой связи в дальнейшем было осуществлено микрочи- пирование ткани почек контрольной и экспериментальной групп с целью оценки характера изменений всех микроРНК в данной ткани после повышения уровня miR-204-5p. Известно, что многие микроРНК действуют синергически, а поэтому изменение уровня одной микроРНК может приводить к изменению уровней экспрессии других микроРНК.

Результаты исследования были получены при помощи ПЦР в режиме реального времени и метода микрочипирования. Был получен разнонаправленный характер результатов. Причинами этого явления может являться небольшой объём выборки. Помимо этого, структура самой микроРНК может приводить к снижению качества отжига при проведении метода микрочипирования, т.к. данная микроРНК обладает относительно большой длиной - 22 пары нуклеотидов, что может приводить к нарушению связывания комплементарных нуклеотидов гена и данной ми- кроРНК образца.

Анализ сигнальных каскадов регулируемых микроРНК с наиболее высоким уровнем изменений, показал наличие трансформации сигнальных механизмов функционально связанных с канцерогенезом, в том числе с почечно-клеточным раком. Подобный результат может указывать на возможное формирование преметастатических ниш в ткани почек у экспериментальных животных.

Для успешного метастазирования опухоли требуются не только формирование локальных ниш в первичном опухолевом узле, но и «преметастатических» ниш в органах-мишенях метастазирования [5]. Формирование преметастатических ниш необходимо для выживания клеток опухоли их инвазии и формировании микрометастазов в отдаленных органах [6]. В процессе формирования преметастатической ниши происходит деградация компонентов внеклеточного матрикса: протеогликанов, гликопротеинов, полисахаридов и др. [7], что приводит к гиперактивации сигнальных каскадов, регулируемых ми- кроРНК с наиболее высоким уровнем изменений.

Нарушения регуляции кальциевого обмена, полученные по данным биоинформатического анализа, могут свидетельствовать также в пользу формирования преметастатических ниш в дистантных органах. Помимо этого, данный феномен может быть связан с активацией кальций-зависимых ферментов, например белка S-100, который является одним из самых изученных на данный момент онкомаркеров меланомы кожи [8].

Биоинформационный анализ генов-мишеней и сигнальных каскадов, регулируемых максимально сниженной микроРНК - miR-26a-5p, выявил у нее 42 гена-мишени. Одним из самых изученных генов-мишеней данной микроРНК был ген EZH2. Роль гена усилителя zeste homolog 2 (EZH2) в канцерогенезе сложна и может варьироваться в зависимости от типа рака или стадии [9]. EZH2 представляет собой высококонсервативную гистоновую метилтрансферазу, которая нацелена на лизин 27 гистона H3 (H3K27) [10]. Гиперэкспрессия EZH2 часто обнаруживается при опухолях различной локализации и коррелирует с поздними стадиями заболевания и с плохим прогнозом [11]. По данным литературы, описана взаимосвязь гена EZH2 и одним из основных драйверных генов при меланоме кожи геном BRAF [12].

Следует отметить, что сочетанное фармакологическое ингибирование с применением вемурафениба (BRAF-ингибитора) и GSK2816126 (EZH2 ингибитора) показало лучший терапевтический эффект по сравнению с монотерапией вемурафенибом [13].

Заключение

Таким образом, можно резюмировать, что модуляция уровня miR-204-5p на модели экспериментальной меланомы на мышах линии C57Bl6 привела к изменениям уровней экспрессии небольшого кластера микроРНК, которые могут участвовать в формировании преметастатических ниш в органах мишенях.