Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого
Модуляция уровня miR-204-5p индуцирует формирование преметастатической ниши в модели меланомы В16 in vivo
С.Н. Лаврентьев, М.Б. Аксененко
А.С. Аверчук, И.С. Зинченко
Красноярск, Российская Федерация
Аннотация
Цель исследования. Определение профиля микроРНК в органах-мишенях метастазирования после экспериментального повышения уровня синтетическим аналогом miR-204-5p in vivo.
Материал и методы. Исследование было выполнено на лабораторных мышах линии C57B16, которым были имплантированы клетки культура меланомы B16 для формирования подкожной солидной опухоли. Животные, которым была привита меланома, были распределены на III группы: контрольная (n = 3); отрицательный контроль (n = 5); опытная (n = 6), животным данной группы был введен синтетический аналог (имитатор) исследуемой микроРНК mir-204-5p, в дозировке 1,2 мг/кг в виде раствора.
Результаты. Исследование экспрессии miR-204-5p в ткани почек, легких и печени экспериментальных животных показало увеличение экспрессии данной микроРНК в 9 раз по сравнению с контролем в тканях почек. Далее было проведено определение экспрессионного профиля микроРНК в этой ткани. Результаты микрочипирования показали, что после введения имитатора miR-204-5p изменяется уровень 12 микроРНК, при этом 9 микроРНК имели пониженный уровень экспрессии более чем в 2 раза. Данные микроРНК участвуют в регуляции генов-компонентов 47 внутриклеточных механизмов передачи сигнала. Механизмы передачи сигнала, регулируемые микроРНК с наиболее высоким уровнем изменений, включали сигнальные пути митогенактивируемых протеинкиназ (МАРК), протеогликанов при раке, почечно-клеточном раке почек, клеточной адгезии, деградации лизина, процессы регуляции реабсорбции кальция и синтеза различных видов гормонов.
Заключение. При введении антисмысловых нуклеотидов их повышенная концентрация, а значит и предполагаемые эффекты, наблюдаются в ткани почек. Анализ сигнальных каскадов, регулируемых микроРНК с наиболее высоким уровнем изменений, показал наличие трансформации сигнальных механизмов функционально связанных с канцерогенезом, в том числе с раком почек. Подобный результат может указывать на возможное формирование преметастатических ниш в ткани почек у экспериментальных животных.
Ключевые слова: микроРНК, miR-204-5p, меланома, сигнальные пути, гены мишени, метастазирование, биоинформатический анализ.
Annotation
miR-204-5p level modulation that induces formation of premetastatic niche in B16 melanoma in vivo model
S.N. Lavrentev, M.B. Aksenenko, A.S. Averchuk, I.S. Zinchenko; Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk state medical university
The aim of the research. Determination of microRNA profile in metastasis target organs after experimental increase of their level by synthetic analogue miR-204-5p in vivo.
Material and methods. The study was performed in laboratory mice of C57Bl6 line who were implanted with B16 melanoma culture cells to form subcutaneous solid tumor. Animals that were inoculated with melanoma were divided into III groups: check (n = 3); negative check (n = 5); experimental (n = 6), animals of this group got synthetic analogue (simulator) of the studied miR-204-5p microRNA, at a dosage of 1.2 mg / kg in the form of a solution.
Results. The study of miR-204-5p expression in tissues of kidneys, lungs, and liver of experimental animals showed an increase in this miRNA expression ninefold compared with the check one in kidney tissues. Next, microRNA expression profile of this tissue was determined. Microchipping results showed that after miR-204-5p simulator introduction, the level of 12 miRNAs changes, while 9 miRNAs had a reduced expression level of more than 2 times. These miRNAs are involved in regulation of component genes of 47 intracellular signal transmission mechanisms. Signal transmission mechanisms regulated by miRNAs with the highest change level included signaling pathways of mitogen-activated protein kinases (MAPK), proteoglycans in case of cancer, renal cell kidney carcinoma, cell adhesion, lysine degradation, regulation of calcium reabsorption and synthesis of various types of hormones.
Conclusion. When introducing antisense nucleotides, their increased concentration, and hence the expected effects, are observed in kidney tissues. Analysis of signaling cascades regulated by miRNAs with the highest change level showed transformation of signaling mechanisms functionally associated with carcinogenesis, including kidney cancer. Similar result may indicate possible formation of premetastatic niches in kidney tissue of experimental animals.
Key words: miRNA, miR-204-5p, melanoma, signaling pathways, target genes, metastasis, bioinformatic analysis.
Введение
Антисмысловые олигонуклеотиды и малые интерферирующие РНК в последнее время приобретают все большую значимость в качестве важных терапевтических моделей для лечения онкозаболеваний. Подавляя трансляцию специфических онкобелков-мишеней, малые РНК способны влиять на развитие новообразований, что делает их эффективным терапевтическим инструментом. Так одним из первых клинически разрешенных препаратов, основанных на антисмысловом механизме, является патисиран, нацеленный на мРНК белка транстиретина (TTR) [1].
Одним из новых и малоизученных направлений в терапии онкозаболеваний с применением антисмысловых олигонуклеотидов, с целью деградации целевой мРНК, является применение микроРНК. МикроРНК - это эндогенные некодирующие РНК, представляющие собой нуклеотидную последовательность, состоящую в среднем из 22 нуклеотидов. В клетке микроРНК посттранскрипционно регулируют многочисленные метаболические процессы, в том числе, по данным ряда исследователей, принимают участие в опухолевой трансформации. Одна микро- РНК может регулировать изменение уровня экспрессии до ста генов [2]. Традиционно применяются два подхода в изменении уровня экспрессии микроРНК. Первое направление - увеличение уровня экспрессии путем применения синтетических аналогов (имитаторов) исследуемой микроРНК; второе - блокирование активности, то есть снижение уровня экспрессии исследуемой микроРНК путем с помощью комплементарных ингибиторов - антисмысловых олигонуклеотидов [3].
Учитывая данные, полученные нами ранее, микроРНК miR-204-5p является одной из наиболее сниженных в меланоме, по сравнению с меланоцитарными невусами [4]. Поэтому введение синтетического аналога данной микроРНК, с целью увеличения уровня экспрессии таргетных белков, рассматривается как одно из возможных направлений терапевтического воздействия.
В данном исследовании была предпринята попытка определения механизмов изменения уровня экспрессии микроРНК miR-204-5p посредством введения синтетического аналога данной микроР- НК на модели меланомы B16 in vivo, определение профиля опосредованного изменения уровней экспрессии микроРНК в ткани почки. На основе полученных данных, с помощью биоинформатического анализа, была проведена детекция опосредованных изменений путей передачи внутриклеточного сигнала с целью определения возможных терапевтических мишеней.
Материал и методы
Исследование было выполнено на лабораторных мышах линии C57B16. Данная инбредная линия лабораторных мышей стандартно используется для воспроизведения модели меланомы кожи. Животные были получены из ФИЦ ИЦиГ СО РАН (г. Новосибирск). Проведение эксперимента одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Яснецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации, (протокол №79/2017 от 22.11.2017). Все исследования и манипуляции с животными выполнялись при соблюдении правил и рекомендаций представленных в приказе Министерства здравоохранения РФ от 01.04.2016 №199н. «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», а также в международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных» и Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Dйclaration of Helsinki 1964, 2008 ред.).
Для моделирования меланомы кожи были использованы половозрелые самки лабораторных мышей линии C57Bl6, средняя масса животных на начало эксперимента составляла 18,5 г. В месте содержания животных поддерживалось естественное освещение, а также средняя температура 20-22°С. Животным был не ограничен доступ к жидкости и корму.
Клеточная культура меланомы B16 предоставлена ФБГУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН и до момента имплантации сохранялась в жидком азоте.
Перед проведением имплантации клетки меланомы размораживались в течение 1 минуты на водяной бане при температуре 37°С. После разморозки культуры на световом микроскопе МИКМЕД-2 вариант 16 (ЛОМО, Санкт-Петербург, Россия) подсчитывалось количество жизнеспособных клеток в камере Горяева под увеличением х400. Для подсчета жизнеспособных клеток к 20 мкл метиленового синего добавляли 20 мкл взвеси клеток, при этом нежизнеспособные клетки окрашивались в синий цвет.
После подготовки и подсчета клеток двум лабораторным животным после обработки операционного поля с соблюдением правил асептики и антисептики в боковую поверхность живота была произведена имплантация культуры клеток в объеме 500 мкл, в количестве 60000 жизнеспособных клеток. На 14 сутки после трансплантации на боковой поверхности живота отчетливо пальпировалась подкожная солидная опухоль в размере 20 мм. Была произведена эвтаназия животных под хлороформным наркозом путем декапитации. С соблюдением правил асептики и антисептики было произведено вскрытие животных, выделение опухолевого узла с последующим промыванием ткани опухолевого узла стерильным раствором RPMI-1640 + L-глутамин (Gibco, Life Technologies, Paisley, UK). Ткань опухолевого узла была гомогенизирована и приготовлен раствор взвеси опухолевых клеток на 1 г опухолевой ткани добавлен 1 мл стерильного раствора RPMI-1640 + L-глутамин (Gibco, Life Technologies, Paisley, UK).
На последующем этапе эксперимента готовую взвесь опухолевых клеток прививали путем подкожной инъекции с соблюдением правил асептики и антисептики лабораторным мышам линии C57B16 (n = 15) для формирования подкожной солидной опухоли. Рост опухолевого узла определяли один раз в трое суток путем пальпации боковой поверхности живота.
У 14 лабораторных животных перевитая меланома дала рост и животные случайным образом были распределены на III группы. I группа (n = 3) контрольная, животным данной группы на 7 сутки внутривенно в боковую вену хвоста однократно, был введен фосфатно-солевой раствор (VWR Radnor, PA, USA), в объеме 200 мкл. Группа II, (n = 5) отрицательный контроль, животным данной группы однократно внутривенно в боковую вену хвоста был введен негативный контроль имитатора mirvana™ mirna Mimic Negative Control #1 (Ambion, Carlsbad, USA) 1,2 мг/кг, конченый объем раствора 200 мкл. III - опытная группа (n = 6), животным данной группы был введен синтетический аналог (имитатор) исследуемой микроРНК miR-204-5p mirVana® miR-204-5p mimic (Ambion, Carlsbad, USA), в дозировке 1,2 мг/кг в виде раствора 7,4 mM в объеме 200 мкл. Для разведения и в качестве трансфектанта был использован Invivofectamine® 3.0 Reagent (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, USA).
Вывод животных из эксперимента осуществляли на 15 сутки путем декапитации под хлороформным наркозом. После вскрытия макроскопически оценивали и взвешивали органы. Для дальнейших исследований фиксировали кусочки ткани в криопробирках в жидком азоте.
Выделение РНК осуществляли в ламинарном боксе с соблюдением правил асептики, антисептики. Перед выделением РНК образцы ткани извлекались из жидкого азота и размораживались на ледяной бане. Во время работы для избегания контаминации образцов руки и стерильные наборы инструментов дополнительно обрабатывали средством для деконтаминации от РНК RNaseZap™ (Applied Biosystems, USA). Из образцов ткани, полученных при вскрытии животных и сохраненных в жидком азоте с помощью набора DiaGene 3317.0050 (Москва, Россия), согласно протоколу производителя и элюировали 150 мкл деионизированной свободной от нуклеаз воды. Концентрацию микроРНК измеряли на флуориметре Qubit® 2.0 (Invitrogen by Life Technologies, Singapore, Singapore) с использованием набора Qubit® microRNA Assay kit (Ref. Q32880, Юджин, Орегон, США). Концентрация микроРНК в образцах, представленных на микрочиповый анализ, превысила 16,2 нг/мкл.
Микрочипирование проводили с использованием системы для микрочипирования GeneAtlas™ (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Использовались образцы РНК с концентрацией микроРНК в диапазоне от 16,2 до 49,8 нг / мкл, подвергались полиаденили- рованию и последующему биотинилированию с использованием Affymetrix® Flash Tag™ Biotin HSR (Ref. 901913, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Меченые молекулы затем гибридизовались при 48 °C в течение 20 ч на массивах в Матрице Affymetrix® miRNA 4.1 Array Strip (Affymetrix, Santa Clara, USA) с использованием модуля гибридизации и окрашивания GeneChip® GeneAtlas™ (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). После гибридизации образцы промывали с использованием буферов и растворов модуля гибридизации и окрашивания GeneChip® GeneAtlas™ (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) системы GeneAtlas™. Интенсивность флуоресцентного сигнала оценивали при помощи системы GeneAtlas™ Imaging Station. Как спайковый контроль олигонуклеотидов, так и контрольные стадии процедуры гибридизации были выполнены в соответствии с инструкциями производителя и под контролем качества. Контроль качества эксперимента проводился автоматически на этапе визуализации и для последующего анализа использовались только образцы, прошедшие порог контроля качества.
Для определения уровней экспрессии исследуемой микроРНК miR 204-5p был произведен анализ ПЦР в реальном времени. Реакцию обратной транскрипции проводили в реакционной смеси, содержащей 2 мкл 5х праймеров специфичных к исследуемой микроР- НК miR-204-5p TaqMan Assays hsa-miR-204-5p (Assay ID 478491, №A25576, Applied Biosystems, Foster City, USA), 4 мкл РНК матрицы, полученный объем разводили стерильной водой свободной от РНКаз до конечного объема 9 мкл., после чего к полученной смеси добавляли 1 мкл фермента MMLV ревертазы по 2 мкл DTT и dNTP и 4 мкл 5x буфера для синтеза первой цепи из набора MMLV RT kit (Евроген, Москва, РФ). Полученную смесь прогревали в течение 2 минут при 70°С. После чего к полученной комплементарной ДНК добавляли 8 мкл 2,5-кратной реакционной смеси РТ-ПЦР и ROX-эталонного красителя (Синтол, Москва, Россия), 1 мкл 20-кратных праймеров, и деионизированную воду до общего объема 20 мкл. U6snRNA и snoRNA 234 (Assay ID 001973, No. 4427975; Applied Biosystems, USA и Assay ID 001234, No. 4427975;
Applied Biosystems, USA) соответственно, были использованы в качестве эндогенных контролей для оценки относительных уровней экспрессии микроРНК. Реакцию проводили на системе StepOne™ Real-Time PCR (Applied Biosystems, Singapore, Singapore) со следующим протоколом циклирования температуры: 50°С в течение 2 мин и 95°С в течение 10 мин, затем 40 циклов 95°С в течение 15 сек и 60°С в течение 1 мин с детекцией FAM/VIC. Для каждого эксперимента было выполнено по три повтора. Экспрессия микроРНК или мРНК нормализовалась до геометрического среднего значения U6 snRNA и snoRNA 234. Данные анализировали с использованием метода AACt.