Материал: микра модуль весь

13. Складні методи фарбування мікроорганізмів. Фарбування за Грамом, фактори, які впливають на фарбування бактерії за Грамом. Практичне значення фарбування за Грамом

Анілінові барвники - органічні сполуки, що утворюються при окисленні аніліну або його солей; широко використовуються в гістологічної техніки, мають бактерицидну, а деякі - канцерогенну дію.

Цей препарат має бактерицидну і бактеріостатичну активність щодо грампозитивних бактерій, особливо стрепто-і стафілококів, а також протипаразитарні і фотосенсібілізуючі властивості.

У медицині використовуються деякі анілінові барвники (фуксин, діамантовий зелений), метиленовий синій, метиловий фіолетовий.

Розрізняють прості і складні (диференціальні) способи фарбування мікроорганізмів. Просте фарбування дозволяє швидко вивчити морфологічні особливості мікроорганізмів. Найбільш придатними є основні і нейтральні анілінові барвники. Для простого забарвлення використовують тільки один барвник, найчастіше червоного кольору - фуксин, фіолетового – генціанвіолет.

Складні методи фарбування:

Метод Ціля-Нільсена призначений для диференціації кислотостійких бактерій (збудників туберкульозу та лепри) від некіслотоустойчівих.

Метод Нейссера використовується для виявлення зерен волютину.

Метод Буррі є негативним методом забарвлення: забарвлюється фон, і не фарбуються самі мікроорганізми. Для цього використовують барвники, не фарбують бактерії, наприклад туш.

Метод Буррі-Гінса використовується для фарбування капсульних бактерій і заснований на тому, що капсула не сприймає барвники.

Метод фарбування за Романовським-Гімзою універсальний метод фарбування. При фарбуванні найпростіших їх цитоплазма набуває блакитний колір, а ядра - червоно-фіолетовий.

Основні відмінності складних методів фарбування від простих: Використання декількох барвників.; Використовування додаткових інгридієнтів, що не мають забарвлюючих властивостей.

Метод Грама є універсальним методом забарвлення і рекомендується для фарбування прокариотических клітин. Фарбування за Грамом є важливим методом для диференціації різних видів мікроорганізмів за тинкторальними властивостями

Фактори, які впливають на фарбування бактерій за Грамом:

• Точне виконання правил приготування мазка,

• тривалості фарбування та знебарвлюваності спиртом.

• Крім того, має значення вік культури та мінливість мікроорганізмів.

Для грам позитивних бактерій є спільне: чутливість до лізоциму, пеніциліну, йоду; нечутливість до дії пепсину панкреатину; слабо виражені імуногенні властивості; можуть бути ксимлостійкими; можуть утворювати ендоспори, екзотоксин; війки не виявлені

Для грам негативних бактерій є спільним: перетравлюються ферментами ШКТ; мало чутливі до дії лізоциму, пеніциліну, йоду; імуногенні властивості добре виражені; чутливі до дії кислот; ендоспор не утворюють; рідко утворюють екзотоксин; можуть утворювати війки

14. Типи і механізми живлення мікроорганізмів. Механізми проникнення поживних речовин в бактеріальну клітину. Хімічний склад мікроорганізмів. Значення складових компонентів. Поживні середовища, вимоги до них. Класифікація поживних середовищ, які використовують у мікробіології

Типи живлення: автотрофи (для створення нових клітин використовують окис водню) і гетеротрофи (використовують готові сформовані органічні сполуки). Гетеротрофи в свою чергу поділяються на сапрофіти (потребують мертві органічні речовини) і паразити (визивають хвороби в тих істотах, в яких живуть)

Механізми проникнення поживних речовин: дифузія, полегшена дифузія, транслокація груп (коли транспортуєма сполука піддається модифікаційним змінам), активний транспорт (затрати енергії)

Мікробні клітини майже цілком складаються з води (біля 80 %). 20 % вмісту клітини припадає на сухі речовини. Якщо їх прийня­ти за 100 %, то хімічний склад клітини буде такий: вуглецю - 46-50 %. кисню - 30, водню - 6-7, азоту - 7-14, мінеральних речовин - 2-14 %. До мінеральних речовин належать фосфор, калій, натрій, магній, сірка, кальцій, хлор, залізо, цинк, бор, хром та інші.

Вода: розчинник для кристалічних речовин, джерело водневих іонів, учасник хім. реакції

Білки: утворюють мембрану на поверхні цитоплазми (ліпопротеїди), здійснюють хім. реакції (ферменти); обумовлюють видову специфічність мікроорганізмів.

Полісахариди: розпадаються на глюкозу, фруктозу, галактозу.

Класифікація поживних середовищ:

-за консистенцією

1)тверді 2)напіврідкі 3) рідкі

-за походженням

1)Природні (сироватка крові, жовч, яйця, молоко, морква)

2)Штучні; 3) Синтетичні

-за призначенням і складом

1)Основні (МПБ, МПА)

2)Диференціально-діагностичні(Середовище Гісса, Середовище Левіна, кровяний МПА, згорнута сироватка)

3)Спеціальний жовчний бульйон, цукровий бульйон, асцит, агар)

Вимоги до поживних середовищем:

• Повноцінність за хім. складом;

• наявність стимуляторів росту;

• певна реакція (рН);

• буферність;

• ізотонічність;

• в’язкість;

• вологість;

• прозорість;

• стерильність.

15. Поживні середовища, вимоги до них. Класифікація поживних середовищ, які використовують у мікробіології

Класифікація поживних середовищ:

-за консистенцією

1)тверді 2)напіврідкі 3) рідкі

-за походженням

1)Природні (сироватка крові, жовч, яйця, молоко, морква)

2)Штучні; 3) Синтетичні

-за призначенням і складом

1)Основні (МПБ, МПА)

2)Диференціально-діагностичні(Середовище Гісса, Середовище Левіна, кровяний МПА, згорнута сироватка)

3)Спеціальний жовчний бульйон, цукровий бульйон, асцит, агар)

Вимоги до поживних середовищем:

• Повноцінність за хім. складом;

• наявність стимуляторів росту;

• певна реакція (рН);

• буферність;

• ізотонічність;

• в’язкість;

• вологість;

• прозорість;

• стерильність.

16. Дихання мікроорганізмів. Аеробний і анаеробний тип дихання. Ферменти і структури клітини ,що беруть участь у процесі дихання. Методи вирощування анаеробних бактерій

Класифікація за типами дихання

Дихання бактерій. Це один із шляхів біологічного окислення, який відбувається з утворенням молекул АТФ, тобто супроводжується нагромадженням енергії. Під час цього процесу одні речовини (органічні та неорганічні сполуки) служать донорами електронів і при цьому окислюються, акцепторами електронів виступають неорганічні сполуки, вони відновлюються. В одних мікроорганізмів кінцевим акцептором електронів виступає кисень, у інших - неорганічні сульфати, нітрати, карбонати.

1.Облігатні аероби - мікроорганізми, для оптимальнгоо росту яких необхідно 21 % кисню. До них належать збудники туберкульозу, чуми, холерний вібріон. На поверхні рідких живильних середовищ вони ростуть, як правило, у вигляді плівки.

2.Облігатні анаероби - бактерії, які ростуть при відсутності вільного молекулярного кисню за рахунок процесів бродіння. Вони одержують кисень з органічних сполук у процесі їх метаболізму. Деякі з них не виносять навіть незначної кількості вільного кисню. Такими бактеріями є збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції, бактероїди, фузобактерії та ін. Окремі клостридії можуть бути аеротолерантними. Для культивування їх використовують спеціальні живильні середовища й апарати (анаеростати), в яких створюються анаеробні умови за рахунок поглинання кисню або заміни його індиферентиними газами (азотом, воднем).

3.Факультативні анаероби (факультативні аероби) пристосувались, залежно від умов середовища (наявності або відсутності кисню), переключати свої метаболічні процеси з використанням молекулярного кисню на бродіння та навпаки. Групу факультативних анаеробів формують численні представники родини кишкових бактерій (ешеріхії, сальмонели, шигели), стафілококи та деякі інші бактерії.

4. Мікроаерофіли - особлива група мікробів, для яких концентрація кисню при культивуванні може бути зменшена до 2 %. Вищі його концентрації здатні затримувати ріст. Ця група представлена молочнокислими, азотфіксуючими бактеріями.

5. Капнеїчними називають такі мікроорганізми, які потребують, крім кисню, ще й до 10 % вуглекислого газу. Типовими представниками є збудники бруцельозу бичачого типу.

В облігатних аеробів кисень використовується як кінцевий акцептор електронів у реакціях, що каталізуються цитохромоксидазами та оксигеназами. В клітинах факультативних анаеробів  також є  цитохромоксидази, проте в облігатних анаеробів ферментів, які каталізують взаємодію з молекулярним киснем, немає.

Броді́ння - біохімічний процес розкладу вуглеводів, що відбувається під впливом мікроорганізмів або їх ферментів.

Ферменти:

-супероксиддисмутаза-конвертує О₂ в Н₂О₂ у аеробів та факультативних анаеробів

-каталаза(пероксидаза)-розщеплює Н₂О₂ до Н₂О і О₂

Методи вирощування анаеробних бактерій

Оскільки для культивування анаеробних бактерій використовують спеціальні

живильні середовища, які не повинні містити кисню і мають низький окисно-

відновний потенціал (-20 -150 мВ), до їх складу вводять індикатори – резазурин,

метиленовий синій тощо, які реагують на зміну цього потенціалу. При його зрос-

танні відновлені безбарвні форми індикаторів змінюють свій колір: резазурин за-

барвлює середовище в рожевий колір, а метиленовий синій – в голубий. Такі зміни

свідчать про неможливість використання середовищ для культивування анаероб-

них мікробів.

Сприяє зниженню окисно-відновного потенціалу введення в середовище не

менше 0,05 % агару, який, збільшуючи його в’язкість, сприяє зменшенню надхо-

дження кисню. Це, в свою чергу, досягається ще й використанням свіжих (не

пізніше двох годин після виготовлення) і редукованих живильних середовищ.

Слід врахувати, що через особливості бродильного типу метаболізму анае-

робних бактерій вони вимагають багатших на живильні компоненти і вітаміни

середовищ. Найчастіше використовують серцево-мозковий й печінковий настої,

соєві та дріжджові екстракти, гідролітичний перевар казеїну, пептон, триптон.

Обов’язковим є додавання факторів росту, таких як твін-80, гемін, менадіон, цільна

або гемолізована кров.

Методи створення анаеробних умов. Враховуючи, що вільний молекуляр-

ний кисень є токсичним для облігатно-анаеробних бактерій, обов’язковою умо-

вою культивування таких мікроорганізмів є обмеження його доступу. Існує ряд

методів (механічних, фізичних, біологічних), які дозволяють це забезпечити.

Фізичні методи.

1. Перед посівом бактерій на живильне середовище його

обов’язково регенерують для видалення надлишку розчиненого кисню. З цією

метою середовище кип’ятять протягом 15-20 хв на водяній бані, а потім швидко

охолоджують до необхідної температури.

2. Для попередження проникненя кисню в середовище його заливають ша-

ром стерильної вазелінової олії або парафіном.

3. Стовпчик живильного середовища у пробірках повинен бути достатньо

високим (10-12 см). Кисень, як правило, дифундує в товщу стовпчика на глибину

до 2 см, тому нижче створюються сприятливі умови для культивування анаероб-

них мікробів.

4. Евакуаційно-замісний метод полягає у використанні анаеростатів. Вони

представляють собою герметичні металеві або пластмасові банки, з яких можна

викачати кисень і замінити його інертним газом (гелій, азот, аргон). Допускається

використання трикомпонентної газової суміші, яка складається з 80 % азоту, 10 %

диоксиду вуглецю та 10 % водню. Деколи допустимим вважається використання

природного газу. Для поглинання кисню, який залишається в анаеростаті, викори-

стовують паладієві каталізатори. З метою поглинання водяної пари використову-

ють хлорид кальцію, силікагель тощо, які поміщають на дно анаеростата.

Хімічні методи.

1. Використання речовин, здатних поглинати кисень. З цією

метою допустимим є застосування лужного розчину пірогалолу. При цьому вра-

ховують поглинаючу активність речовини: на 100 мл ємності герметичної посуди-

ни, в якій знаходяться чашки Петрі, використовують 1 г пірогалолу і 10 мл 2,5 N

розчину гідроксиду натрію.

Киснезв’язуючий ефект має також гідросульфіт натрію (Na2S2O4). Для зв’язу-

вання кисню в 1 л повітря використовують суміш, яка складається з 100 мл свіжо-

го 20 % розчину Na2S2O4 і 16 мл 50 % гідроксиду калію.

2. Застосування речовин-редуцентів. Враховуючи, що ріст облігатно-анаероб-

них бактерій відбувається в середовищах з низьким рівнем окисно-відновного

потенціалу, до них додаються спеціальні відновлювачі: цистеїн (0,03-0,0,5 %), тіо-

гліколеву кислоту або тіогліколат натрію (0,01-0,02 %), сульфід натрію, аскорбі-

нову кислоту (0,1 %), різноманітні цукри.

Функції відновлювачів можуть виконувати шматочки паренхіматозних органів

тварин (печінка, нирки, серце) або навіть рослин (картопля, інші коренеплоди).

Ступінь поглинання кисню або ступінь відновлення середовища вимірюють

або електрометрично або за допомогою індикаторів (резазурин, нейтральний чер-

воний, феносафранін).

3. Використання спеціальних газогенеруючих систем, які дозволяють ство-

рити безкисневі умови в мікроанаеростатах, транспортних пластикових пакетах

тощо. Однією з найпоширеніших є система “Gas Generating Box”. До її складу

входять хімічні генератори водню (борогідрит натрію) та вуглекислого газу (таб-

летки бікарбонату натрію та лимонної кислоти), а також паладієвий каталізатор,

який поглинає кисень.

Чашки з посівами поміщаються в мікроанаеростат, на дні якого знаходиться

шар паладієвого каталізатору. Кінчик пакета “Gas Generating Box” надрізають но-

жицями, і в нього наливають 10-15 мл води. Пакет розташовують у мікроанаеро-

статі. Через 15-20 хв у ньому створюються анаеробні умови. Водень, який виді-

ляється, взаємодіє з киснем, утворюючи воду, а вуглекислота продукується при

взаємодії бікарбонату натрію з лимонною кислотою.

Біологічні методи. 1. Метод Фортнера. Метод полягає в спільному культи-

вування на одному середовищі аеробних і анаеробних мікроорганізмів. Спочатку

по діаметру чашки вирізають полоску агару шириною до 0,5-1,0 см. З одного боку

засівають досліджуваний метралі, що містить анаеробні збудники, а з іншого –

мікроби, що є індикатором анаеробних умов (Serratia marcescens або “чудесна па-

личка”). Краї чашки парафінують або закривають пластиліном. За деякий час на

поверхні середовища виростають колонії як аеробних, так і анаеробних мікробів.

При поглинанні кисню Serratia marcescens дає ріст блідо-рожевих або безбарвних

колоній, а при порушеннях герметичності – яскраво-червоні. На іншій половині

чашки виростають колонії анаеробних мікробів.

2. Метод Хеннеля (“годинникових скелець”). Він є своєрідною модифікацією

попереднього. Матеріал, що містить анаеробні збудники, засівається на поверхню

живильного середовища діаметром 2-2,5 см. Зверху він покривається “годиннико-

вим склом”, заповненим шаром МПА і засіяним Serratia marcescens. Аеробні мікро-

би, поглинаючи кисень, створюють умови для сприятливого росту анаеробних

збудників.