Статья: Методы определения бактериального ожога на растениях семечковых культур в западной части Азербайджана

Таблица 4 РАСТВОРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ОКРАСКЕ ПО ГРАМУ

Проводили тест на окрашивание по Граму, чтобы определить, являются ли полученные бактериальные изоляты грам (+) или грамотрицательными (Таблица 4).

Тест KOH. Этот тест проводился для всех изолятов, полученных в ходе анализа. После добавления в стакан капли свежеприготовленного 3%-ного раствора гидроксида калия его отбирали у очищенных бактерий в искусственную питательную среду с помощью посевной палочки, добавляли к раствору и волнообразно перемешивали в течение 15-20 секунд. Нитевидное удлинение наблюдалось при поднятии инокулятивной палочки. Появление положительной реакции, то есть изолят по Граму (-), а отсутствие удлинения -- отрицательная реакция, то есть изолят по Граму (+) [14].

Все изоляты показали положительную реакцию на тест КОН. Другими словами, в результате теста произошло нитевидное удлинение в результате разрушения клеточной стенки изолятов в KOH.

Каталазный тест. Этот тест проводился для всех полученных изолятов. В химический стакан добавляли 1 мл 3%-ного перекиси водорода (H₂O₂), затем очищенные бактерии собирали инокулятивной палочкой и смешивали с раствором. Образование пузырьков воздуха в результате реакции показало, что изолят отреагировал положительно [12].

Окислительно-ферментативный тест: Для определения утилизации углеводов в аэробной и анаэробной среде проводили окислительно-ферментативный тест (Таблица 5).

Таблица 5

ОКИСЛИТЕЛЬНО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ТЕСТ

После того, как вышеуказанные химические вещества были измерены с использованием электронных весов, за исключением агара, и растворены в колбе Эрленмейера, pH раствора доводили до 7,0--7,1 с помощью 40% NaOH, и цвет среды становился оливково-зеленым. Среду гомогенизировали после добавления агара и автоклавирования при 121°С. Полученную смесь разделили на пробирки по 6-7 мл и стерилизовали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут и оставляли замерзать в вертикальном положении. 10 г глюкозы растворяли в 100 мл дистиллированной воды и далее стерилизовали методом тиндализации. Его готовили в количестве 0,5 мл и добавляли к питательным средам, приготовленным в пробирках емкостью 6-7 мл в асептических условиях при температуре 45-50 °С.

Для каждого бактериального изолята использовали две пробирки с кислородом и одну без кислорода. В пробирки через палочку вносили инокулят из очищенных бактерий на специальных питательных средах. Затем в одну из этих пробирок наливали 3%-ный агар, прекращали его контакт с воздухом и создавали бескислородную среду. Пробирки маркировали и закрывали ватой, а изоляты инкубировали при 24-26°C в течение 7-14 дней. В конце инкубационного периода он меняет цвет с оливково-зеленого на желтый в результате продукции кислоты из глюкозы в экспонированных и экспонированных пробирках [1].

Изоляты меняли цвет среды с оливково-зеленого на желтоватый, в этом случае результат теста считался положительным. В результате этого теста было установлено, что все изоляты осуществляли факультативное анаэробное дыхание.

Тест на растворение желатина. Химические вещества, приведенные ниже, взвешивали в соответствии с заданными размерами и гомогенизировали при 121°C, добавляя 1 л дистиллированной воды. В пробирки через палочку вносили инокулят из очищенных бактерий на специальных питательных средах. Чтобы понять, расплавилась среда в пробирке или нет, пробирки перед анализом выдерживали в холодильнике при +4°С в течение 30 минут, разжижение среды в пробирке оценивали как положительный случай, а затвердевание как отрицательный случай [10].

Все изоляты E. amylovora, инокулированные в подготовленные стеклянные пробирки, растворяли твердый желатин в жидкости.

Флуоресцентная пигментация: После линейного посева среды King Б от очищенных бактерий на специальные питательные среды через инокуляционную палочку ее инкубировали в течение 2 суток в инкубаторе при температуре 24-26°С. Чтобы обнаружить флуоресцентные свойства растущих культур, их исследовали под УФ (ультрафиолетовым) трансиллюминатором, и те, которые продуцировали сине-зеленый пигмент, оценивались как положительные, а другие -- как отрицательные [9].

Рост изолятов при 36°C. Изоляты, выращенные на среде с питательным агаром (NA), инкубировали в инкубаторе при 36°C в течение 2-3 дней и оценивали как положительные или отрицательные, если на среде происходил рост бактерий. Все изоляты, высеянные в среду NA, инкубировали при 36°С в течение 2-3 дней, и в конце инкубации у всех изолятов не было обнаружено развития колоний.

Тест на сырые груши: незрелые груши сначала тщательно промывают в водопроводной воде, затем выдерживают в 10%-ном гипохлорите натрия в течение 2-4 минут, затем стерилизуют поверхность, пропуская через стерильную воду 3 раза. В стерильной камере из груш нарезали ломтики толщиной 7-8 мм, специальным инструментом вскрывали отверстия и помещали их в стерильные влажные чашки Петри. Бактериальные изоляты плотностью 108 клеток/мл заносили пипеткой в лунки на этих срезах и инкубировали при 27°С. Были отобраны изоляты, вызывающие размягчение тканей и бактериальный экссудат [19].

Все изоляты показали положительную реакцию на тест с сырой грушей. Иными словами, в лунках, засеянных бактериальной суспензией, наблюдались характерные выделения молочного цвета (бактериальный экссудат) E. amylovora.

Проверка пектолитической активности на картофеле. Клубни картофеля промывали щеткой в проточной воде, выдерживали в 1% растворе NaOCl в течение 2-4 минут для дезинфекции поверхности и трижды промывали стерильной водой. Клубни картофеля очищали стерильным скальпелем после прохождения через пламя. После этого процесса клубни картофеля нарезали ломтиками толщиной 7-8 мм и вскрывали лунки с помощью стерилизованного специального инструмента. Срезы помещали на стерильную влажную фильтровальную бумагу в стерильные чашки Петри. В лунки пипеткой добавляли по 25 мкл бактериальной суспензии, приготовленной из бактериальных изолятов, выращенных на питательной среде НА. Инкубировали в инкубаторе при температуре 25°С в течение двух дней. Размягчение в инокулированных лунках оценивалось как положительное [12].

Тест на чувствительность (RH) табака. Все изоляты выращивали в среде NA при 2426°C в течение 24-48 часов и готовили суспензии с концентрацией 108 клеток/мл. Эти суспензии вводили между двумя эпидермисами между жилками на нижней поверхности листа табака (Nicotiana tabacum сорта Samsun Н) с помощью стерильной иглы для подкожных инъекций. Инъецированные растения инкубировали в течение 48-72 часов и наблюдали реакцию чувствительности.

Таблица 6

УСЛОВИЯ PCR-АНАЛИЗА НА E. amylovora

Заключение

В проведенных исследованиях в западной части Азербайджана определена современная ситуация с E. amylovora, которая является одним из возбудителей бактериального заболевания растений, вызывающего потери урожая плодовых растений. В собранных пробах проводили процесс выделения бактериального возбудителя, биохимический анализ и определение патогенности. По анализам получен положительный результат.

В результате проведенных исследований отражена современная ситуация с E. amylovora, являющейся возбудителем бактериального фитофтороза в грушевых садах западного региона страны.

Список литературы:

1. Ayers S. H., Rupp P A study of the alkali-forming bacteria found in milk. US Department of Agriculture, 1919. №782.

2. Bastas K. K. First report of Erwinia amylovora on firethorn (Pyracantha coccinea) and

Mountainash (Sorbus sp.) in Turkey // Plant disease. 2012. V. 96. №12. P. 1818-1818.

https://doi.org/10.1094/PDIS-01-12-0014-PDN

3. Bastas K. K., Sahin F. First report of fire blight caused by Erwinia amylovora on meadowsweet (Spirea prunifolia) in Turkey // Plant Disease. 2014. V. 98. №1. P. 153-153. https://doi .org/10.1094/PDIS -03 -13 -0220-PDN

4. Bora T., Karaca І. Kultur bitkilerinde hastaligin ve zararin olgulmesi // Ege Universitesi Yardimci Ders Kitabi, Yayin. 1970. V. 167

5. Cabrefiga J., Montesinos E. Analysis of aggressiveness of Erwinia amylovora using disease-dose and time relationships // Phytopathology. 2005. V. 95. №12. P. 1430-1437. https://doi.org/10.1094/PHYTO-95-1430

6. Aksoy H. M., Armagan O. Z. Bakteriyel patojenlere kar§i bitkilerdeki dayaniklilik

mekanizmalari // Anadolu Tarim Bilimleri Dergisi. 2012. V. 27. №3. P. 165-173.

https://doi.org/10.7161/anajas.2012.273.165

7. Schaad N. W., Jones J. B., Chun W. Laboratory guide for the identification of plant pathogenic bacteria. - American Phytopathological society (APS press), 2001. №. Ed. 3.

8. King E. O., Ward M. K., Raney D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin // The Journal of laboratory and clinical medicine. 1954. V. 44. №2. P. 301-307. https://doi.org/10.5555/uri:pii:002221435490222X

9. Darrell J. H., Wahba A. H. Pyocine-typing of hospital strains of Pseudomonas pyocyanea // Journal of Clinical Pathology. 1964. V. 17. №3. P. 236. https://doi.org/10.1136%2Fjcp.17.3.236

10. Klement Z., Rudolph K., Sands D. C. Methods Bn Phytobacteriology // Akademia Kiado, Budapest, XIV+ 568s. 1990.

11. Lazarov A., Grigorov P Karantina na rastenijata Zemizdat //Sofia, Bulgaria. 1961.

12. Lelliott R. A., Stead D. E. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell Scientific Publications, 1987.

13. Mansfield J., Genin S., Magori S., Citovsky V., Sriariyanum M., Ronald P., Foster G. D. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology // Molecular plant pathology. 2012. V. 13. №6. P. 614-629. https://doi.org/10.1111/j.1364-3703.2012.00804.x

14. Sands D. C. Physiological criteria-determinative tests // Methods in phytobacteriology. 1990. P.133-143.

15. Schaad NW, Jones JB, Chun W (2001) Laboratory Guide for the Identification of Plant Pathogenic Bacteria (No. Ed. 3). American Phytopathological Society (APS Press)

16. Soylu E. M., Soylu S., Merve K. A., §ener K. U. Sebzelerde sorun olan onemli bitki fungal hastalik etmenlerine kar?i vermikomposttan izole edilen mikrobiyomlarin in vitro antagonistik etkilerinin belirlenmesi // Kahramanmara? Sutgu imam Universitesi Tarim ve Doga Dergisi. 2020. V 23. №1. P. 7-18. https://doi.org/10.18016/ksutarimdoga.vi.601936

17. Taylor R. K., Guilford P. J., Clark R. G., Hale C. N., Forster R. L. S. Detection of Erwinia

amylovora in plant material using novel polymerase chain reaction (PCR) primers // New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 2001. V. 29. №1. P. 35-43.

https://doi.org/10.1080/01140671.2001.9514158

18. Van Der Zwet T., Keil H. L. Fire blight: A bacterial disease of rosaceous plants. US Department of Agriculture, 1979. №510.

19. Zwet T. Identification, symptomatology, and epidemiology of fire blight on Le Conte pear in the Nile Delta of Egypt // Plant disease. 1986. V. 70. №3. P. 230-234. https://doi.org/10.1094/PD- 70-230

20. Van Der Zwet T., Keil H. L. Fire blight: A bacterial disease of rosaceous plants. US Department of Agriculture, 1979. №510.

References:

1. Ayers, S. H., & Rupp, P. (1919). A study of the alkali-forming bacteria found in milk (No. 782). US Department of Agriculture.

2. Bastas, K. K. (2012). First report of Erwinia amylovora on firethorn (Pyracantha coccinea)

and Mountainash (Sorbus sp.) in Turkey. Plant disease, 96(12), 1818-1818.

https://doi .org/10.1094/PDIS-01-12-0014-PDN

3. Bastas, K. K., & Sahin, F. (2014). First report of fire blight caused by Erwinia amylovora on meadowsweet (Spirea prunifolia) in Turkey. Plant Disease, 98(1), 153-153. https://doi .org/10.1094/PDIS-03 -13 -0220-PDN