Статья: Методы определения бактериального ожога на растениях семечковых культур в западной части Азербайджана

Методы определения бактериального ожога на растениях семечковых культур в западной части Азербайджана

Гулиева З. М.

Аннотация

Бактериальный ожог, вызываемый Erwinia amylovora (Burrill, 1882) Winslow et al., 1920, приводит к значительным потерям производства в странах, которые являются первыми в мире по производству семечковых культур. Основной путь заражения многих плодовых культур, в том числе яблонь и груш проходит через вновь распустившиеся цветки. Бактерия зимует в ткани коры по краю язв, образовавшихся на ветвях и стеблях в результате заражения в предыдущем году и становится источником заражения в следующем. Определение распространенности болезни на территориях с большим количеством плодовых садов важно с точки зрения борьбы с болезнью. Поэтому целью работы является изучение распространенности заболевания в Гянджа-Дашкесанском и Газах-Товузском экономических районах, а также точная диагностика полученных изолятов E. amylovora классическими и молекулярными методами. Для этого деревья в исследуемых яблоневых и грушевых садах были обследованы на болезнь, из зараженных растений выделен возбудитель, проведены морфологический, биохимический, физиологический и молекулярный анализы. Среди 36 бактериальных изолятов, полученных из 27 образцов зараженных растений, в 11 в результате морфологических, биохимических, физиологических и молекулярных тестов была определена Erwinia amylovora.

Ключевые слова: плодоводство, яблоня, груша, плодовые сады, эрвиния, бактериальный ожог, молекулярное определение.

METHODS FOR THE DETERMINATION OF FIRE BLIGHT ON POME FRUIT CROP PLANTS IN THE WESTERN PART OF AZERBAIJAN

Guliyeva Z. эрвиния бактериальный ожог amylovora

Abstract. Fire blight caused by Erwinia amylovora (Burrill, 1882) Winslow et al., 1920 causes significant production losses in the world's leading pome fruit crop producing countries. The main route of infection of many fruit crops, including apple and pear trees, is through newly blooming flowers. The bacterium overwinters in the bark tissue along the edges of cankers formed on branches and stems as a result of infection in the previous year and becomes a source of infection in the next year. Determining the prevalence of the disease in areas with a large number of orchards is important from the point of view of disease control. Therefore, the purpose of the work is to study the prevalence of the disease in the Ganja-Dashkesan and Gazakh-Tovuz Economic Regions, as well as the accurate diagnosis of the obtained E. amylovora isolates using classical and molecular methods. For this purpose, trees in the studied apple and pear orchards were examined for the disease, the pathogen was isolated from infected plants, and morphological, biochemical, physiological and molecular analyzes were carried out. Among 36 bacterial isolates obtained from 27 samples of infected plants, Erwinia amylovora was identified in 11 as a result of morphological, biochemical, physiological and molecular tests.

Keywords: fruit growing, Malus, Pyrus, orchards, Erwinia amylovora, fire blight, molecular determination.

Большая часть общего объема сельскохозяйственной продукции нашей страны приходится на садоводство. Яблоки и груши имеют для Азербайджана большой потенциал с точки зрения производства и территории. В 2021 году на посевной площади в Гянджа - Дашкесанском и Газах-Товузском экономических районах было 2576,4 га яблок, 1409,5 га груш и 372,8 га айвы.

Существует множество фитопатогенных вирусов, грибов и бактериальных заболеваний, влияющих на продуктивность и качество семечковых растений. Среди этих заболеваний одним из наиболее вредоносных бактериальных заболеваний является бактериальная ожоговая болезнь. Согласно всемирному исследованию, бактериальный ожог вызывает Erwinia amylovora (Burrill, 1882) Winslow et al., 1920, входящая в десятку основных бактериальных заболеваний, влияющих на урожайность и качество сельскохозяйственных культур во всем мире [2, 3, 5, 12].

E. amylovora -- грамотрицательный факультативно-анаэробный палочковидный и перитрихозный жгутиковый бактериальный фитопатоген, принадлежащий к семейству Enterobacteriaceae [14]. Клетки бактерий вирулентного или авирулентного типа имеют размеры 0,6-2,5х0,5-1,2 мкм. Точка термической гибели бактерий, растущих in vitro при температуре 21-28°С, составляет 45-50°С, а оптимальное развитие рН -- 6,0-7,5°С. В литературе сообщается, что возбудитель вызывает заболевание у 129 видов растений, принадлежащих к 37 родам семейства Розоцветные. К наиболее важным плодовым деревьям, экономически повреждаемым E. amylovora, относятся груша, яблоня, айва [16].

Материал и методы исследования

Исследования проводились в селе Гапанлы Шамкирского района, Гейгельского, Самухского, Товузского районов. В мае-августе 2019 года были проведены маршрутные проверки в районах выращивания яблок и груш. Исследования проводились в 5 разных яблоневых и 6 разных грушевых садах в 8 различных селах 4 районов. Количество деревьев, подлежащих изучению при маршрутных обследованиях, рассчитывалось по общему количеству деревьев в каждом научном центре с учетом количества деревьев в регионах [10] и определялось для включения в исследование. Зараженность деревьев выражали по шкале тяжести заболевания от 1 до 10 [16].

В обследованных садах рассчитывали частоту распространения болезни (P -- распространенность), процент зараженности (I -- заболеваемость) и тяжесть заболевания (S -- тяжесть) [4].

В лабораторию для выделения было доставлено 27 различных образцов с типичными симптомами заболевания, которые хранились в холодильнике при температуре +4°C до начала выделения процесса заболевания. Основным объектом исследования являются заболевания основных бактериальных болезней (Erwinia amylovora) яблони, груши и айвы. У сортов Голден Делишес, Гала больные образцы (побеги, листья, ветки) собирали с деревьев с признаками бактериального ожога в апреле, мае, июне, июле. Наблюдения в садах проводились по модели Лазарова [10], а минимальное количество деревьев, подлежащих обследованию в садах, определялось по общему количеству деревьев (Таблица 1).

Таблица 1

Тяжесть заболевания у растений измеряли по шкале от 1 до 10, адаптированной Zwet и Keil [20] (Таблица 2).

Таблица 2

СТЕПЕНЬ РАЗВИТИЯ БОЛЕЗНИ У РАСТЕНИЙ

Тяжесть заболевания, заболеваемость и распространенность болезни в исследуемых садах рассчитывали по формулам Бора и Караджи [2].

После определения распространенности болезни на деревьях по шкале от 1 до 10 рассчитывали тяжесть болезни (S), процент заражения болезнью (I) и распространенность болезни (Р) в саду по следующим формулам:

Сбор образцов. Симптоматические образцы следует собрать индивидуально или в клубок и как можно скорее доставить в лабораторию и либо начать анализ, либо сохранить при температуре 4-8°С. Образцы были собраны из цветков, клубнелуковиц, ветвей, стеблей и плодов с симптомами заболевания. Прежде всего, необходимо четко определить симптомы заболеваний. Хотя отобранные образцы имеют симптомы заболеваний, являющихся объектом исследования, более целесообразно, чтобы эти заболевания не находились на последних стадиях своего развития. При сборе проб следует соблюдать осторожность, чтобы не собрать сильно поврежденные части растений. Потому что в поврежденных частях с большей вероятностью будут присутствовать сапрофитные организмы. По этой причине собранные образцы должны быть свежими и зелеными [6, 7].

При отборе проб из симптоматического зоба следует использовать некротические и здоровые части. При отборе проб цветов берут один или несколько цветков вместе со стеблем. При сборе проб следует отбирать листья, особенно с некротическими жилками (лист не должен быть полностью покрыт симптомом). При отборе пробы из стебля пробу берут из части, на которой проявляются симптомы, путем ее отрыва от слоя коры стебля с помощью стерильного ланцета.

Изоляция. После того, как собранные образцы были завернуты в бумагу, их доставили в растительную клинику отдела защиты растений АДАУ в полиэтиленовом пакете с холодовой цепью. По мнению Х. М. Аксо, в эпифитный период патогенных бактерий необходимо собирать большое количество проб. Например, Pseudomonas syringae pv. syringae при изолировании в пыльниках рекомендуется собирать образцы из 100 листьев, 200 побегов, 200 цветков или 100 плодов [6].

Для процесса выделения необходимы свежеприготовленные экстракты. После промывки образцов водопроводной водой для поверхностной дезинфекции образцов можно использовать 70%-ный спирт или 1%-ный раствор NaOCl (выдерживать 2-3 минуты). Образцы, промытые водопроводной водой, протирали и поверхность дезинфицировали 70% спиртом. Образцы промывали 3 раза (выдерживая каждый раз по 15-20 секунд) стерильной водой, а затем сушили сушильной бумагой. Образцы тканей, содержащие больные и здоровые части, помещали в стерильные полиэтиленовые пакеты для измельчения и гомогенизировали в физиологическом буфере (0,85% NaCl) или стерильной дистиллированной воде с добавлением пестика и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут. Из полученных образцов через микропипетку отбирали 70 мкл, добавляли к искусственной питательной среде Nutrient Agar (NA) и культивировали с помощью багета. Посаженные чашки Петри выдерживали в инкубаторе при температуре 26°С в течение 24-48 часов. В течение инкубационного периода чашки Петри периодически проверяли для наблюдения за ростом бактерий. Колонии светло-молочного цвета отбирали из колоний, образовавшихся на питательной среде NA, линейно высаживали на искусственную питательную среду King B и выдерживали в инкубаторе при температуре 26°C в течение 24 часов 36 бактериальных колоний из 27 инфицированных образцов были очищены и сохранены в 30% глицерине при температуре 20°С для биохимических, физиологических, биохимических и молекулярных диагностических тестов [8].

Питательные среды, используемые в анализах. Их высевали в чашки Петри, содержащие искусственные питательные среды, содержащие агар Кинга Б и 5% сахарозный агар (СНА). После инкубации чашек Петри при 25°C в течение 48 часов отбирали и очищали нефлуоресцентные колонии бактерий левантного типа.

Патогенность очищенных изолятов проверяли на плодах груши, а также на сорванных побегах и соцветиях груши. Изоляты диагностировали по реакции Грама, росту колоний на средах King B и SNA, а также тесту на гиперчувствительность к табаку (Таблица 3).

Таблица 3

ПИТАТЕЛЬНЫЙ АГАР (NA)

Обсуждение и анализ исследования

Для диагностики болезнетворных бактерий были проведены биохимические и физиологические анализы. Для диагностики использовали гидроксид калия (KOH), колонии левана типа на 5% сахарозном питательном агаре (СНА), оксидазную, аргининдегидролазную, окислительно-ферментационную, индолообразовательную и гидролизную реакции желатина. Применяли рост возбудителя при 36°C, образование помутнения в среде LB, содержащей 5% NaCl, и тесты на чувствительность (HR) в табаке [7, 15, 16].