Материал: Методическое пособие. Общая микробиология

г) Для определения нитрифицирующих бактерий сеют почвенные разведения во флаконы с минеральной средой Виноградского, разлитой тонким слоем. В ходе эксперимента два флакона со средой оставляют незасеянными в качестве контроля чистоты среды. Посевы инкубируют при температуре 28 °С в течение 14-15 сут. При развитии нитрифицирующих бактерий в среде образуются азотистая и азотная кислоты, которые определяют на 5-7 сутки после посева и вторично – на 14-15. Титр нитрифицирующих бактерий определяют качественной реакцией с дифениламином, который в присутствии азотистой и азотной кислот даёт синее окрашивание. Пастеровской пипеткой несколько капель среды из каждого флакона, не взмучивая осадок, переносят на стеклянную или фарфоровую пластинку, добавляют несколько капель дефениламина, разведённого концентрированной серной кислоте. Синее окрашивание указывает на присутствие в среде продуктов метаболизма нитрифицирующих бактерий. Среда контрольных флаконов должна оставаться без изменения окраски.

Контрольные вопросы

Какие микроорганизмы называют санитарно-показательными?

В чем сущность прямого метода санитарной оценки объектов внешней среды?

Какие существуют показатели-критерии косвенного метода индикации микроорганизмов внешней среды?

Что такое общее микробное число, и какие методы его определения вы знаете?

Какие микроорганизмы относятся к первой группе СПМО?

Какие бактерии называют колиформными?

Какие колонии образуют на среде Эндо типичные лактозоположительные бактерии?

Какие микроорганизмы относятся ко второй группе СПМО?

Что такое титр СПМО?

Что такое индекс СПМО?

Какие микробиологические показатели определяют при оценке качества питьевой воды централизованного водоснабжения?

Как определяют ОМЧ воды?

Что такое ОКБ и ТКБ?

В чем сущность метода мембранных фильтров при определении ОКБ и ТКБ воды?

Какие фильтры используют при исследовании воды?

Какие методы обнаружения микроорганизмов в воде вы знаете?

Как определяется ОКБ в почве?

Какие методы используются для определения БГКП в почве?

В чем сущность бродильного метода определения БГКП?

В каких случаях используется прямой поверхностный посев почвы на плотные питательные среды?

Что такое перфрингенс-титр, и какими методами он определяется?

Какие питательные среды используют для определения перфрингенс-титра?

Какие СПМО почвы вы знаете?

Какие показатели определяют при санитарном анализе почвы?

Какую роль в почве выполняют аммонификаторы и нитрификаторы?

Какие микробиологические показатели определяются при исследовании воздуха?

Что такое резидентная микрофлора воздуха?

Что такое транзиторная микрофлора воздуха?

Какие санитарно-показательные микроорганизмами при исследовании воздуха в закрытых помещениях вы знаете?

На каком принципе основан метод Коха при санитарно-микробиологическом исследовании воздуха?

Какие недостатки имеет метод Коха?

Как можно использовать результаты, полученные при исследовании воздуха методом Коха?

В чем сущность аспирационного метода изучения микрофлоры воздуха?

Какие приборы для отбора проб воздуха вы знаете?

Какие достоинства имеет аспирационный метод исследования воздуха?

Что такое общая бактериальная обсемененность воздуха?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 10.

Санитарно-показательными называют микроорганизмы, являющиеся постоянными обитателями естественных полостей тела человека и животных, которые способны постоянно выде­ляться во внешнюю среду.

Санитарно-показательные микроорганизмы должны соответствовать следующим требованиям.

1. Постоянное обитание в естественных полостях человека и живот­ных и постоянное выделение во внешнюю среду.

2. Отсутствие размножения во внешней среде.

3. Длительность выживания и устойчивость во внешней среде не меньше или даже выше, чем у патогенных микроорганизмов.

4. Отсутствие «двойников», с которыми СПМО можно перепутать.

5. Относительно низкая изменчивость во внешней среде.

6. Наличие простых в исполнении и надёжных методов индикации.

В качестве СПМО предложено довольно много микроорганизмов, их можно условно разделить на три группы.

          • Индикаторы фекального загрязнения (представители микрофлоры кишечника человека и животных);

          • Индикаторы воздушно-капельного загрязнения (комменсалы верхних дыхательных путей);

          • Индикаторы процессов самоочищения (обитатели внешней среды).

В состав первой группы СПМО входят:

• БГКП (бактерии группы кишечных палочек);

• энтерококки;

• протей;

• сульфитредуцирующие клостридии;

• термофилы, бактериофаги кишечные, сальмонеллы;

• бактероиды, бифидо- и лактобактерии;

• синегнойная палочка;

• кандида;

• ацинетобактер.

В состав второй группы входят стрептококки и стафилококки.

В третью группу входят:

• протеолиты;

• аммонификаторы и нитрификаторы;

• аэромоносы и бделловибрионы;

• споровые микроорганизмы;

• грибы и актиномицеты;

• целлюлозобактерии.

Тump – минимальное количество субстрата (в кубических сантиметрах или граммах), в котором ещё обнаруживают СПМО.

Индекс – количество СПМО, которое содержится в 1 л воды или в 1см³ другого субстрата.

Общее микробное число и методы его определения

Общее микробное число (ОМЧ) – число всех микроорганизмов в 1 мл или в 1 г субстрата.

При этом учитывают, что чем боль­ше микроорганизмов обнаружено во внешней среде, тем вероятнее загрязнение патогенными микроорганизмами. В связи с этим ОМЧ даёт представление об эпидемиологической обстановке.

Существуют три метода определения ОМЧ.

1. Оптический метод прямого подсчёта бактерий под микроскопом в камере Горяева.

2. Бактериологический метод (менее точный).

3. Измерение биомассы.

Оптический метод обычно используют на водопроводных станциях при оценке эффективности работы очистных сооружений, но он не позволяет отличить живые бактерии от мёртвых. Исследование можно выполнить в течение 1 ч, поэтому метод незаменим в аварийных ситуациях. Метод позволяет судить о состоянии процессов самоочищения воды. В начальной стадии процесса самоочищения грамотрицательных бактерий больше, чем грамположительных, а палочковидных форм больше, чем кокковых. На завершающей стадии соотношение меняется на обратное.

Бактериологическим методом выявляют определённую физиологи­ческую группу бактерий, растущих при данных условиях. Например, обнаружение вегетативных форм микроорганизмов в прошедшем термическую обработку пищевом продукте свидетельствует о пов­торном заражении продукта после термической обработки или же о неэффективности последней. Обнаружение спор подтверждает удов­летворительное качество термической обработки.

Измерение биомассы осуществимо только в специализированных лабораториях путём взвешивания остатков бактериальной массы, определения показателей клеточного обмена и др. В практике этот метод не применяют.

ОМЧ определяют в следующих случаях:

• контроль качества очистки воды (в том числе колодезной);

• проверка эффективности мойки посуды;

• контроль чистоты воздуха в закрытых помещениях;

• определение свежести скоропортящихся продуктов;

• выбор места для строительства жилых объектов (исследование почвы);

• определение характера микрофлоры

Методы обнаружения микроорганизмов в воде.

Для обнаружения микроорга­низмом в воде и других биосубстратах и определения их количества могут быть использованы бактериологический и микроскопический методы.

Основные этапы бактериологического исследования: гомогенизация образца, десорбция микроорганизмов с плотных частиц, приготовле­ние разведений, посев на питательные среды, идентификация выде­ленных культур.

Гомогенизацию образца проводят для равномерного распределения бактерий в анализируемом объекте. При исследовании жидких, плот­ных, сыпучих продуктов, в зависимости от характеристик испытуе­мого материала, используют перемешивание простым встряхиванием или специальные приборы.

Десорбция бактерий с плотных частиц необходима для анализа объектов твёрдой консистенции. Для этого материал суспензируют в жидкости или с поверхности объекта берут смывы и отпечатки. При суспензировании к навеске образца массой 10 г добавляют 90 см³ воды и интенсивно перемешивают (вручную или в гомогенизаторе). В даль­нейшем условно принимают 1 см³ полученной суспензии эквивалент­ным 0,1 г исходного материала.

Общие колиформные бактерии – грамотрицательные, оксидазонегативные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре +37 °С в течение 24-48 ч.

Термотолерантные колиформные бактерии – входят в состав ОКБ и обладают всеми их признаками, но ферментируют лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре +44 °С в течение 24 ч.

Сульфитредуцирующие клостридии  спорообразующие анаэроб­ные палочковидные микроорганизмы, восстанавливающие сульфит натрия в условиях культивирования на железо-сульфитном агаре при температуре 44 °С в течение 16-18 ч.

Коли-фаги – бактериальные вирусы, способные лизировать Е. coli и формировать при температуре 37 °С через 18 ч зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре.

Санитарно-показательные микроорганизмы, характеризующие загрязнение почвы.

Общее количество бактерий  количество микроорганизмов, образующих колонии на МПА при температуре 37 °С в течение 24 ч,  суммарный показатель микробиологического загрязнения почвы микрофлорой преимущественно фекального происхождения.

Термофильные микроорганизмы  микроорганизмы, образующие колонии на МПА при температуре 60 °С в течение 24 ч,  показатель загрязнения почвы компостом или навозом. Почвы, показывающие высокое содержание кишечных палочек и низкое  термофилов, считают фекально загрязнёнными.

БГКП  грамотрицательные не образующие спор короткие палочки, ферментирующие лактозу и глюкозу до кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24-48 ч, не обладающие оксидазной активностью.

Перфрингенс-титр  титр грамположительных облигатно-анаэробных спорообразующих палочек, восстанавливающих сульфиты. Присутствие Clostridium perfringens (споровых форм) свидетельствует о давнем фекальном загрязнении.

Аммонификаторы  микроорганизмы, превращающие азот в катионы аммония. Аммонификация (гниение) белков  результат деятельности гнилостной микробиоты (актиномицеты, грибы, анаэробные бациллы). Высокое содержание в почве этой микробиоты свидетельствует о присутствии органических веществ.

Нитрификаторы  микроорганизмы, окисляющие азот из солей аммония в нитраты и нитриты. К этой группе относятся представители родов Nitrosococcus, Nitrosolobus, Nitrosobacter. Их присутствие свидетельствует о наличии органического загрязнения и активно идущих процессах самоочищения.

Аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмы  почвенная микробиота, использующая целлюлозу в качестве источника углерода. В этой группе велика роль неспоровых бактерий, базидиальных, дрожжеподобных и несовершенных грибов.

Общая численность сапрофитов  количество микроорганизмов образующих колонии на МПА при температуре 28-30 °С в течение 72 ч. Высокая численность сапрофитной микробиоты свидетельствует об органическом загрязнении почвы.

Патогенные микроорганизмы  сальмонеллы (Salmonella spp.), патогенные клостридии (С. tetani, С. botulinum), возбудитель сибирской язвы (Bacillus anthracis), вирусы.

З А Н Я Т И Е 11

Дата ______________

Тема: Санитарно-бактериологическое исследование воды, воздуха, почвы (2 день). Исследование кала на дисбактериоз (разбор схемы).

План занятия:

1. Знакомство с микрофлорой человеческого тела. Регистрация результатов посева отпечатков пальцев и слизи из зева.

2. Провести регистрацию результатов посева воздуха седиментационным методом Р. Коха.

3. Исследование кала на дисбактериоз (разбор схемы).

Методические указания

1. Сосчитать количество колоний, выросших на МПА и среде Эндо из посевов отпечатков пальцев, особо обратив внимание на колонии кишечной палочки на среде Эндо. Промикроскопировать при ок­раске по Граму несколько колоний со среды Эндо и МПА.

Промикроскопировать колонии, выросшие при посеве слизи из зева (окраска по Граму). Результаты работы оформить в виде протокола.

Протокол исследования микрофлоры пальцев рук

Протокол исследования выросшей микрофлоры слизистой оболочки зева

2. Провести подсчет выросших колоний из воздуха седиментационным методом Коха, используя формулу Омелянского. Полученные результаты зарегистрировать в рабочей тетради, промикроскопировать при ок­раске по Граму несколько колоний, зарисовать и заполнить протокол исследования отдельной колонии.

Расчет по модифицированной формуле Омелянского ведется на 1 м² поверхности:

X = n^.10⁴ / ^.r^2.t = _______________________________________________________________

где X - ОМЧ воздуха обследуемого помещения (КОЕ); п - количество колоний на чашке (КОЕ); t - время экспозиции чашки (мин); ^.r^{2 -} площадь чашки Петри (см²); 10⁴ - пересчет м² в см².

Протокол исследования колонии.

1.Размер колонии_______________________________________

2.Форма колонии_______________________________________

3. Поверхность колонии_________________________________

4. Края колонии________________________________________

5.Прозрачность колоний_________________________________

6.Пигмент_____________________________________________

7.Консистенция________________________________________

8.Форма бактерий______________________________________

9. Взаиморасположение бактерий_________________________

10.Латинское морфологическое название бактерий__________

3. Для бактериологического исследования используются свежие фекалии, со­бираемые в стерильную посуду (пробирки или пенициллиновые фла­коны) без консерванта. Материал должен быть исследован в течение 2 часов с момента дефекации.

Существует несколько методов исследования микрофлоры ки­шечника, большинство из которых сводится к количественному ис­следованию предварительно взвешенной навески фекалий.

Взвешивание проводится на стерильной пергаментной бумаге (навеска должна быть в пределах 0,5-1,0 г.), которая затем помещается в фарфоровую ступ­ку и заливается таким количеством фосфатно-тиогликолевого буфе­ра, чтобы получилось соотношение 1:10. Содержимое ступки тщательно растирается и отстаивается в течение 10 мин для оседания плотных частиц. Затем 0,5 мл содержимого из ступки переносится в пробирку с 4,5 мл фосфатно-тиогликолевого буфера и тщательно перемешива­ется. В дальнейшем материал последовательно раститровывается по 0,5 мл в 6-ти пробирках (получаются десятикратные разведе­ния). Из 6-й пробирки материал в количестве 0,1 мл переносится в пробирку с 9,9 мл буфера, а из неё 0,1  в следующую пробирку с аналогичным количеством буфера. Таким образом, в ступке содержится разведение материала 10^-1, а в последней пробирке – 10^-11. Посев целесообразно начинать с разведения 10^-11, исполь­зуя концевую пипетку на 1,0 мл.

Для выделения бифидобактерий по 0,1 и 1,0 мл из разведе­ний 10^-11, 10^-9 и 10^-7 засевают в пробирки с регенерированной средой Блаурокка; при этом получается 6 пробирок с разведения­ми от 10^-7 до 10^-12.