Материал: Методическое пособие. Общая микробиология

5. В настоящее время имеется много стабильных штаммов клеток, пассируемых вне организма в течение многих лет. Эти культуры клеток называют перевиваемыми культурами ткани, или растущими культурами ткани. К ним относятся штаммы клеток, полученные из злокачественных опухолей и из нормальных тканей человека и животных: 1) штамм клеток Неla – клетки карциномы шейки матки человека; 2) штамм клеток Нер-2 – клетки злокачественной опухоли гортани человека; 3) штамм клеток Детройт-6 – клетки, выделенные из костного мозга человека, больного раком легких; 4) штаммы клеток А-0 и А-1 – клетки амниона человека; 5) штамм клеток ЕRК-клетки почек эмбриона кролика; 6)штамм клеток СОЦ - клетки сердца обезьяны Macacus cyn omolgus и многие другие. Эти штаммы клеток применяются только для диагностики вирусных заболеваний. Они не могут быть использованы для изготовления вакцинных вирусных препаратов, так как культуры клеток, полученные даже из нормальных тканей, в процессе длительных пересевов приобретают характер злокачественного роста.

Посмотреть под микроскопом демонстрационные препараты культур ткани и зарисовать.

6. Для поддержания роста клеток пересев делают через 6-7 дней. Количество клеток за это время увеличивается в 4-10 раз. При пересеве для отслаивания клеток от стекла используют 0,02% раствор Версена (двунатриевая соль этилендиаминотетраацетата – Na₂ЭДТА). При добавлении его к культуре клеток он связывает кальций и магний, благодаря которым клетки прикреплены к стеклу, и клетки отслаиваются от стекла.

Предварительно из пробирки или флакона удаляют питательную среду, затем в пробирку вносят 0,5 мл раствора версена, а во флаконы-матрацы объемом 150-200 мл - 10 мл и 25 мл версена соответствен­но. Сосуды помещают в термостат на 20-30 мин, после чего слегка встряхивают. Взвесь вносят в пробирки, центрифугируют при 1000 об/мин 5-10 мин, раствор версена удаляют, а клетки ресуспендируют в питательной среде, Подсчитывают в камере Горяева концентрацию клеток и взвесь разводят до концентрации 200000 клеток в 1 мл. Взвесь вносят по 1-2 мл в пробирки. Пробирки закрывают резиновыми пробками, отмечают карандашом по стеклу лицевую сторону пробирок и помещают их в наклонном положении в термостат.

Подсчитать концентрацию смытых клеток с помощью камеры Горяева и сделать посев культуры клеток в пробирки.

7. Просмотреть монослой выросших клеток и заразить культуру ткани вирусом осповакцины. Техника заражения состоит в следующем. Вирус вакцины разводят синтетической средой 199 в отношении 1:3 и обрабатывают антибиотиками. Из пробирки с культурой ткани стерильной пастеровской пипеткой отсасывают питательную среду. В пробирку вносят I мл разведенного средой вируса вакцины, плотно закрывают ее резиновой пробкой и помещают в термостат в горизонтальном штативе.

8. Существует несколько методов заражения куриных эмбрионов: на хорионаллантоисную) оболочку, в аллантоисную полость, амниотическую полость, в желточный мешок. Для заражения используют эмбрионы 5-11-дневного возраста. Перед заражением эмбрионы просматривают в темной комнате при помощи овоскопа для проверки их жизнеспособности (живые эмбрионы подвижны с хорошо развитыми сосудами) и определения воздушной камеры и места расположения эмбриона. Место на столе, где производят манипуляции, покрывают салфеткой, смоченной в растворе хлорамина.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку. Яйцо устанавливают в штативе в вертикальном положении тупым концом вверх. Скорлупу над воздушной камерой обрабаты­вают спиртом, йодом, повторно спиртом, обжигают, прокалывают ножни­цами небольшое отверстие, через которое в полость воздушного мешка вводят одну браншу ножниц и срезают скорлупу над ним. Затем анатомическим пинцетом захватывают в складку и осторожно снимают внутренний листок подскорлуповой оболочки. Под ней находится хорионаллантоисная оболочка, на которую пастеровской пипеткой наносят исследуемый материал в количестве 0,2-0,5 мл. Отверстие скорлупы закрывают стерильным стеклянным колпачком, который закрепляют на яйце расплавленным парафином. Зараженное яйцо помещают в термостат при 37^° на 48 часов.

3аражение в аллантоисную полость. После подготовительной работы скорлупу прокалывают над воздушной камерой и через небольшое отверстие вводят иглой шприца или пастеровской пипеткой на глубину 1-1,5 см материал в объеме 0,1-0,2 мл. Отверстие заливают парафи­ном.

Заражение в амниотическую полость. После удаления скорлупы над воздушной камерой бранши пинцета вводят в аллантоисную полость в направлении эмбриона на глубину 2-2,5 см, захватывают амниотическую оболочку, выводят ее из глубины, прокалывают иглой шприца и в амниотическую полость вводят материал в количестве 0,1 мл. Отверстие в скорлупе закрывают колпачком и парафинируют.

Заражение в желточный мешок (этим методом чаще пользуются для выделения риккетсий). Просмотреть 5-8-дневный эмбрион с помощью овоскопа, отметить границу воздушной камеры и место расположения эмбриона. Исследуемый материал вводят эмбрионам длинной иглой (4-5 см) через небольшое отверстие в скорлупе над воздушной камерой на глубину 2-3 см. При этом надо не повредить зародыш. Во время манипуляции он должен находиться ниже желточного мешка.

Ввести эмбриону на хорионаллантоисную оболочку вирус осповакцины или в аллантоисную полость вирус гриппа.

Контрольные вопросы

Чем отличаются вирусы от всех остальных живых организмов?

Что такое вирион? Что такое капсид, нуклеокапсид, пеплос (суперкапсид)?

Какой тип симметрии может иметь нуклеокапсид?

Какие признаки используются для классификации вирусов?

Почему вирусы считаются облигатными паразитами?

Какие методы используются для культивирования вирусов?

Как заражают новорожденных мышеи?

Что собой представляют тельца Негри и какими методами их окрашивают?

Что такое культура ткани?

Ткани каких органов используются для получения культур клеток?

Как получают культуру первично-трипсинизированной ткани?

Что такое перевиваемые культуры ткани?

Какие Вы знаете штаммы перевиваемых клеток?

Какие среды и солевые растворы применяют для выращивания и для обработки культур ткани?

Как подсчитывают количество клеток и с какой целью?

В каком положении ставят пробирки в термостат и сколько вре­мени выращивают клетки до заражения их вирусом?

По каким признакам судят о размножении клеток?

Как делают пересев клеток для поддержания данного штамма в лабораторных условиях?

Как отбирают пробирки с культурой ткани для заражения вирусом?

Как выглядят растущие клетки?

Как готовят вируссодержащий материал для заражения культуры ткани?

На сколько времени ставят зараженные пробирки в термостат?

Каково строение куриного эмбриона?

Какого возраста эмбрионы используются для заражения?

Как определяет место расположения эмбриона при овоскопии?

Как обрабатывается эмбрион перед заражением?

Какие существуют метода заражения куриного эмбриона?

На сколько времени ставят зараженный эмбрион в термостат для размножения вируса?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 8.

А. Основные отличия вирусов от других живых организмов.

1. Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа - ДНК или РНК. Все другие организма содержат нуклеиновые кислоты обоих типов.

2. Воспроизведение вирусов осуществляется из одной их нуклеиновой кислоты, в то время как прочие организмы репродуцируются из совокупности своих составных частей.

3. Вирусы не способны к росту и бинарному делению.

4. У вирусов отсутствуют собственные знергообразующие системы.

5. У вирусов нет собственных белоксинтезирующих систем.

Отсутствие у вирусов собственных энергообразующих и белоксинтезирующих систем характеризует их как абсолютных внутриклеточных паразитов.

Б. Критерии современной классификации вирусов.

1. Нуклеиновая кислота: тип, число нитей, процентное содержа­ние, молекулярная масса, содержание гуанина и цитозина.

2. Морфология: тип симметрии или псевдосимметрия, число капсомеров для вирусов с кубической симметрией, наличие внешней липопротеидной оболочки, форма, размеры вирионов.

3. Биофизические свойства: константа седиментации, плавучая плотность.

4. Белки: количество структурных белков и их локализация, аминокислотный состав.

5. Липиды.

6. Размножение в тканевых культурах: особенности репликации.

7. Круг поражаемых хозяев: особенности патогенеза инфекционного процесса; онкогенные свойства.

8. Устойчивость к физическим и химическим факторам (гамма-лучи, термоинактивация при 37^° С и 56^° С , действие жирорастворителей и отдельных катионов).

9. Антигенные свойства.

В. Для культивирования и выделения вирусов используют следующие методы:

а) заражение лабораторных животных;

б) заражение куриных эмбрионов;

в) заражение культур тканей (клеток).

Характеристика культур тканей.

I. Однослойные культуры клеток

1. Первично-трипсинизированная культура ткани – взвесь клеток, полученная путём обработки тканей протеолитическими ферментами (трипсин, папаин и др.). Трипсинизацией достигается разделение кле­ток за счет переваривания межклеточного вещества. Такие клетки, помещенные в питательную среду, растут в виде монослоя и дают однослойную культуру ткани. Первично-трипсинизированная культура ткани выдерживает несколько пересевов, а затем погибает.

2. Перевиваемые клетки - культура клеток, сохраняющая способность к размножению вне организма неопределенно длительное время.

II. Суспензии клеток.

Г. Типы вирусных геномов

РНК-геномы

1. Одноцепочечная нефрагментированная РНК, обладающая матричной актив­ностью (позитивная, или +РНК). Пикорнавирусы, флавивирусы, тогавирусы и др.

2. Одноцепочечная нефрагментированная РНК, не обладающая матричной активностью (негативная, или –РНК). Вирион имеет в своем составе фермент РНК-зависимую-РНК-полимеразу (транскриптазу). Она синтезирует на вирионной РНК матричную РНК, необходимую для трансляции вирусспецифических белков. Парамиксовирусы, рабдовирусы и др.

3. Одноцепочечная фрагментированная РНК, не обладающая матричной актив­ностью (негативная РНК); вирион имеет транскриптазу. Ортомиксовирусы (РНК вириона состоит из 8 фрагментов).

4. Двухцепочечная фрагментированная РНК; вирион имеет транскриптазу. Реовирусы (10 фрагментов).

5. Вирусы, геном которых представлен двумя идентичными нитями позитивной РНК (диплоидный геном). Вирионы имеют обратную транскриптазу. Ретровирусы.

6. Одноцепочечная кольцевая РНК. Такой геном имеет только один вирус — вирус дельта-гепатита. Это дефектный вирус, для размножения его необходим ви­рус-помощник (вирус гепатита В).

ДНК-геномы

1. Одноцепочечная линейная ДНК. Парвовирусы: «+» и «—» нити находятся в разных вирионах, но транскрибируется только «—» нить.

2. Одноцепочечная кольцевая ДНК. Фаги М13, φX174.

3. Двухцепочечная линейная ДНК. Вирусы герпеса и др.; ранняя мРНК синтези­руется в ядре клеточным ферментом.

4. Двухцепочечная кольцевая ДНК. Паповавирусы, вирус гепатита В и др.; ранняя мРНК синтезируется в ядре клеточным ферментом.

5. Двухцепочечная ДНК с ковалентно связанным терминальным гидрофобным белком. Аденовирусы; ранняя мРНК синтезируется клеточным ферментом в ядре.

6. Двухцепочечная ДНК, замкнутая на каждом конце ковалентной связью. Вирус оспы; размножение происходит в цитоплазме, ранняя мРНК синтезируется вирус­ным ферментом.

Д. Особенности репликации вирусов

1. Двунитчатая ДНК - обычная полуконсервативная репликация.

2. Однонитчатая ДНК – репликация происходит через стадии репликативной формы и промежуточной репликативной формы.

3. Однонитчатая РНК – репликация происходит через две стадии. Вначале на вирионной РНК (вРНК) синтезируются комплементарные РНК (кРНК). Затем на кРНК синтезируются вирионные РНК.

4. Репликация однонитчатой РНК ретровирусов происходит с участием обратной транскриптазы. Вначале на вРНК обратная транскриптаза синтезирует минус-цепь ДНК, а затем на ней синтезирует плюс-цепь ДНК. Двунитевая ДНК служит матрицей для синтеза вРНК.

5. Размножение вируса гепатита В также протекает с участием обратной транскриптазы. Вначале клеточная РНК-полимераза синтезирует на вирусной ДНК прегеномную РНК, а затем вирусная обратная транскриптаза синтезирует на ней минус-цепь ДНК, на которой затем достраивает плюс-цепь ДНК.

Е. Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний

1. Вирусоскопический – обнаружение в исследуемом материале с помощью методов электронной микроскопии вирионов или с помощью светооптической микроскопии вирионов или внутриклеточных включений.

2. Обнаружение вирусов в исследуемом материале с помощью методов иммуноэлектронной микроскопии.

3. Вирусологические методы – выделение чистых культур вирусов и их идентификация с использованием культур клеток или куриных эмбрионов.

4. Серологические методы – обнаружение противовирусных антител в сыворотке больного или реконвалесцента с помощью реакций нейтрализации вирусов, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации, иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного метода (РИМ), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), реакции гемагглютинации иммунного прилипания (комплекс АГ+АТ в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах), реакции преципитации в агаре, иммунофлуоресцентного метода. Эти же реакции могут быть использованы и для обнаружения вирусных ан­тигенов в исследуемом материале.

5. Биологические методы – заражение чувствительных к данному вирусу лаборатор-ных животных с целью воспроизведения заболевания или последующего выделения вируса.

6. Молекулярно-генетический – с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или гибридизации нуклеиновых кислот (ДНК- и РНК-зонды) определяют в исследуемом материале наличие возбудителя вирусного заболевания по специфичным для него последовательностям нуклеотидов.

З А Н Я Т И Е 9

Дата ______________

Тема: Идентификация вирусов. Серодиагностика. Генетические методы диагностики (молекулярная гибридизация, полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Итоговое контрольное занятие «Общая вирусология и генетика».

План занятия:

1.Культивирование вирусов в культурах тканей (окончание):

а) изучение цитопатического эффекта - макро- и микроскопии культур клеток, зараженных вирусом осповакцины;

б) выявление размножения вирусов в культуре ткани реакцией гемадсорбции (демонстрация готовых препаратов);

в) обнаружение вируса в культуре ткани методом цветной пробы (демонстрация);

г) выявление вируса в культуре ткани методом бляшек (демонстрация);

д) обнаружение вируса в культуре ткани с помощью флуоресцирующих антител. Разбор методики.

2. Культивирование вирусов в курином эмбрионе (окончание):

а) вскрытие зараженных куриных эмбрионов и изучение изменений в них;

б) постановка реакции гемагглютинации;

в) определение типа вируса гриппа в аллантоисной жидкости с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

3. Итоговый контроль по теме «Общая вирусология и генетика МО».

Методические указания

1. а) Цитопатический эффект - дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса. Микроскопически цитопатическое действие выражается в различных изменениях морфологии клеток, образовании гигантских многоядерных клеток (симпластов), пикнозе ядер и, наконец, в полной деструкции клеток. Макроскопически заметно слущивание клеток со стенок пробирки. Характер клеточной дегенерации зависит, в основном, от вида вируса.

Промикроскопировать культуру ткани, зараженную вирусом осповакцины. Зарисовать.

б) Гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток.

Методика реакции. В пробирки о зараженной вирусом культурой ткани вносят 0,2 мл 0,4% взвеси эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют в наклонном положении. Длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубация и вида вируса. Учёт реакции производят под малым увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного отмывания. Адсорбируясь на поверхности пораженных вирусом клеток, эритроциты образуют характерные скопления.

Зарисовать картину гемадсорбции.

в) Цветная реакция. В основу реакции положено то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, снижающие рН среды. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, в силу чего подавляется их метаболизм и не происходит изме­нение рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый красный. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7 – оранжевый и при рН ниже 7 – желтый.

Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой), рH питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. В случае размножения вируса клетки дегенерируют, и среда сохраняет исходный красный цвет.

Метод цветных проб может быть использован для титрования ви­руса или вируснейтрализирующих антител.

Цветные пробы зарисовать.

г) Метод бляшек предложен Р. Дюльбекко для получения изолированных колоний вируса. В основе метода лежит появление в монослое зараженных вирусом клеток обесцвеченных участков, состоящих из дегенерированных клеток. Эти участки, получившие название бляшек, представляют собой колонии вируса, образующегося из одной вирусной частицы.

Метод заключается в следующем. В специальном флаконе на стенке выращивают монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражают вирусом и заливают агаром, содержащим индикатор нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону, и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек разной формы и величины, что зависит от вида вируса.

Феномен бляшкообразования зарисовать.