Материал: Методическое пособие. Общая микробиология

4. Методика посева смывов на общую бактериальную обсемененность.

Общую бактериальную обсемененность определяют для установления эффективности санитарной обработки посуды в посудомоечных машинах, а также при оценке новых моющих и дезинфицирующих средств. Для этого перед посевом в пробирку с тампоном (смыв) добавляют 5 мл 0,1% пептонной воды или изотонического раствора хлорида натрия. Тампон тщательно отмывают, после чего 1,0 мл смывной жидкости помещают в чашку Петри и заливают расплавленным МПА. Чашки помещают в термостат при 30 °C. Предварительный подсчет выросших колоний производят через 48 часов, окончательный  через 72 часа. Количество колоний, выросших на чашке, умножают на 10 для определения общего количества бактерий, содержащихся на поверхности исследуемого предмета.

5. Метод отпечатков на «Бактотест» со средой Эндо при санитарно-бактериологическом контроле на объектах питания.

Данный метод рекомендуется использовать для контроля эффективности санитарной обработки рабочих поверхностей, кухонного инвентаря, посуды, спецодежды и рук обслуживающего персонала.

«Бактотесты» представляют собой круглые ванночки площадью 10 см² с крышками, выпускаемые стерильными, упакованными по 24 штуки в герметизированные пеналы и предназначенные для разового использования. Перед началом исследования необходимо приготовить среду Эндо в соответствии с наставлением по ее применению, открыть пенал с «Бактотестами», вынуть их из пенала и снять крышки; расположить «Бактотесты» на горизонтальной поверхности; прокипяченную и слегка остуженную среду Эндо разлить по 2 мл в каждую ванночку; после застывания и охлаждения среды Эндо ванночки закрыть крышками и упаковать в пеналы. Подготовленные к работе «Бактотесты» можно хранить при комнатной температуре в течение 4-х суток в сухом и защищенном от света месте.

Взятие отпечатков проводят готовыми (заправленными) «Бактотестами» путем легкого прижатия средой Эндо к обследуемой поверхности. При этом на один «Бактотест» берут 10 отпечатков (обследуемая площадь 100 см²) с поверхности больших предметов: разделочные доски, столы, весы, кастрюли, котлы, разделочные ножи, разливные ложки, тарелки, спецодежда обслуживающего персонала; один «Бактотест» используют для обследования трех мелких предметов: стаканы, чашки, столовые и чайные ложки, вилки, столовые ножи; при обследовании рук обслуживающего персонала на один «Бактотест» делают отпечатки со всех пальцев. Использованные «Бактотесты» маркируют восковым карандашом и упаковывают в пенал, закрыв крышками. После взятия отпечатков проводят инкубацию «Бактотестов» со средой Эндо в термостате при 37 °С в течение 18-24 часов. Выросшие колонии, подозрительные на бактерии группы кишечной палочки по внешнему виду и по морфологии мазков, окрашенных по Граму, высевают на среду Гисса с глюкозой в пробирки с поплавками с последующей инкубацией в термостате при 37 °С в течение 18-24 часов. Заключение о наличии микробов группы кишечной палочки на обследованных объектах делается на основании образования кислоты и газа в пробирках со средой Гисса.

Контрольные вопросы

Как определяют количество БГКП?

Какие этапы выявления сальмонелл вы знаете?

Что такое элективные и селективные питательные среды?

Какие характерные колонии образуют сальмонеллы на элективных средах?

Какие среды обогащения вы знаете?

Какие характерные колонии образуют сальмонеллы на селективных средах?

Что является ведущим свойством при установлении патогенности стафилококков?

В чем сущность реакции плазмокоагуляции?

Как оцениваются результаты коагулазного теста?

Какие санитарно-показательные микроорганизмы продуктов питания вы знаете?

Как осуществляется санитарно-микробиологический контроль на объектах питания?

С помощью каких приспособлений производится взятие смывов?

Какие существуют рекомендации при взятии смывов?

В течение какого времени после взятия смывов следует проводить их анализ?

В чем заключается методика посева смывов на общую бактериальную обсемененность?

Как осуществляется санитарно-бактериологический контроль методом отпечатков?

Что представляет собой «Бактотест»?

В каких случаях проводятся санитарно-бактериологические исследования на объектах питания?

Что служит объектами санитарно-бактериологических обследований в местах общественного питания?

Какие микроорганизмы являются индикаторами санитарного неблагополучия на пищевых предприятиях?

Какие методы отбора проб с предметов обихода вы знаете?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 12.

Краткая характеристика основных санитарно-показательных микроорганизмов продуктов питания

1. Под БГКП понимают грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лак­тозу при температуре 36±1 °С с образованием кислоты и газа. При этом учитывают как цитратположительные, так и цитратотрицательные разновидности микроорганизмов.

2. Энтерококки  грамположительные кокки, располагающиеся пара­ми, короткими или длинными цепочками, каталазоотрицательные. Типовой вид  Enterococcus faecalis. Согласно СанПиН 2.3.2.1078-01, количество энтерококков регла­ментировано в ряде быстрозамороженных готовых блюд:

• в блюдах из мяса животных и птиц  не более 1000 КОЕ/г;

• в блюдах из рубленого мяса животных и птиц, а также в блинчиках с мясом  не более 2000 КОЕ/г.

3. Сальмонеллы вызывают первичные инфекции у животных и человека, заканчивающиеся нередко летальным исходом, а также осложняют течение заболеваний вирусной и бактериальной этиологии. У перебо­левших животных длительное время отмечается бессимптомное сальмо-неллоносительство. При употреблении инфицированных продуктов животного происхож­дения (мяса, молока, яиц) сальмонеллы вызывают у человека пищевые отравления (токсикоинфекции).

4. Сульфитредуцирующие клостридии  крупные неподвижные бациллы длиной 4-8 мкм и шириной 1-1,5 мкм, в живом организме образуют капсулы, а в окружающей среде  центральные или субтерминальные овальные споры. Типовой представитель  Clostridium perfringens.

5. Стафилококки  бактерии, имеющие сферическую форму и размер 0,5-1,5 мкм, в результате деления более чем в одной плоскости обра­зуют гроздевидные скопления, неподвижные, грамположительные. Типовой вид  S. aureus. Образуют внеклеточные ферменты и ток­сины и при определённых условиях могут стать причиной пищевых интоксикаций.

6. Бактерии рода Proteus - полиморфные грамотрицательные палочки размерами 1-3 мкм в длину и 0,4 мкм в ширину. Располагаются попарно или цепочками, спор и капсул не образуют, подвижны. К роду отно­сятся два вида микроорганизмов  P. mirabilis и P. vulgaris. Присутствие в пищевых продуктах микроорганизмов этой группы  признак начала гнилостных изменений. Указанные бактерии также могут быть при­чиной пищевых токсикоинфекций.

7. Listeria monocytogenes  подвижная, грамположительная, микроаэ-рофильная, не образующая спор палочка, патогенная для человека, животных и птиц. Заболевание характеризуется септическими явлени­ями, поражением центральной нервной системы. Наряду с тяжёлыми клиническими проявлениями встречаются лёгкие формы заболева­ния и носительство. Листерии длительно сохраняются (в высушенном состоянии  до 7 лет) и могут даже размножаться в пищевых продуктах при низких температурах хранения. Как факторы передачи листериоза наибольшую опасность представляют мясные (мясо заражённых свиней) и молочные продукты.

Правила и техника взятия смывов для санитарно-бактериологических исследований на объектах питания

Взятие смывов производится с помощью стерильных увлажненных ватных тампонов. Стерильные ватные тампоны на стеклянных, металлических или деревянных палочках, вмонтированных в пробирки с ватными пробками, заготавливают заранее в лаборатории. В день взятия смывов в каждую пробирку с тампоном наливается (в условиях бокса над горелкой) по 5 мл стерильного 0,1% водного раствора пептона или изотонического раствора хлорида натрия таким образом, чтобы ватный тампон не касался жидкости. Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют наклонением пробирки или опусканием тампона в жидкость. В процессе отбора смывов рекомендуется неоднократное смачивание тампонов.

При взятии смывов необходимо пользоваться следующими рекомендациями:

1) Из оборудования следует обращать внимание на разделочные доски, мясорубки, производственные столы для готовой пищи, особенно в цехе приготовления холодных закусок.

2) Смывы с рук, с санитарной одежды, полотенец берутся в основном у работников, имеющих дело с продукцией, не подвергающейся в дальнейшем тепловой обработке (персонал кухни, холодного цеха, раздатчицы, буфетчицы, официанты, продавцы).

3) Смывы с крупного оборудования и инвентаря берут с поверхности в 100 см², для ограничения поверхностей используют шаблон (трафарет), сделанный из проволоки, металлической пластинки. Трафарет имеет площадь 25 см², чтобы взять смывы с площади в 100 см², его накладывают 4 раза в разных местах поверхности контролируемого объекта.

4) При взятии смывов с мелких инструментов обтирается вся поверхность предмета, при заборе смывов с тарелок протирают всю внутреннюю поверхность. При взятии смывов с мелких предметов одним тампоном протирают три одноименных объекта  три тарелки, три ложки и т.п. У столовых приборов протирают их рабочую часть.

5) При исследовании стаканов протирают внутреннюю поверхность и верхний наружный край стакана на 2 см вниз.

6) При взятии смывов с рук протирают тампоном ладонные поверхности обеих рук, проводя не менее 5 раз по каждой ладони и пальцам, затем протирают межпальцевые пространства, ногти и подногтевые пространства.

7) При взятии смывов с санитарной одежды протирают 4 площадки по 25 см²  нижнюю часть каждого рукава и 2 площадки с верхней и средней частей передних пол спецовки. С различных мест полотенца берут 4 площадки по 25 см².

После проведения смыва тампон вкладывают в ту же пробирку, погружая в жидкость. На каждой пробирке отмечают порядковый номер. Под тем же номером записывают в протокол наименование объекта, с которого взят смыв. При взятии смывов с рук и санитарной одежды записывают фамилию, имя и отчество сотрудника, выполняемую работу (профессия, участок работы). Смывы доставляют в бактериологическую лабораторию в течение 2 ч. Допускается их хранение и транспортирование не более 6 ч при температуре +1-10 °С.

З А Н Я Т И Е 13

Дата ______________

Тема: Химиопрепараты. Антибиотики. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам.

План занятия:

1. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам (разбор схемы).

2. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

а) метод дисков;

б) метод серийных разведений;

в) определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста.

Методические указания

1. Для определения чувствительности бактерий (на примере стафилококка) к антибиотикам взять петлей колонию, размешать ее в пробирке с МПБ, чтобы получилось заметное помутнение бульона. 2-3 капли полученной эмульсии нанести в центр чашки с МПА и тщательно растереть по всей поверхности агара. Разделить дно чашки с тыльной стороны карандашом на 4 сектора, надписать на секторах названия антибиотиков и положить в центр каждого сектора прокаленным и остуженным пинцетом диск с соответствующим антибиотиком.

Измерить и записать в таблицу диаметр зоны задержки роста стафилококка каждым антибиотиком. Сформулировать и записать вывод о степени чувствительности выделенной культуры к различным антибиоти­кам.

Регистрация чувствительности к антибиотикам выделенной культуры стафилококка

Вывод:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. а) Метод дисков. Бумажные диски, пропитанные определенными антибиотиками, поме­щают на газон исследуемой бактериальной культуры в чашке Петри, По­севы инкубируют в течение 16-24 часов, после чего учитывают результаты опыта по образованию зон задержки роста бактерий.

По диаметру зон задержки роста ориентировочно судят о степени чувствительности бактерий к антибиотикам (рис. 2). Зона задержки роста до 15 мм указывает на слабую, до 25 мм - на среднюю и свыше 25 мм - на вы­сокую чувствительность. Более точные результаты получают при исполь­зовании метода серийных разведений.

б) Метод серийных разведений. Этот метод позволяет определить минимальную задерживающую концентрацию антибиотика для данного микроорганизма (МЗК) как на жидких, так и на плотных питательных средах.

МПБ разливают по 2 мл в серию пробирок. Готовят основной раствор антибиотика, для чего берут навеску антибиотика и растворяют в дис­тиллированной воде из расчета 1 мг антибиотика на мл растворителя.

Левомицетин предварительно растворяют в 96° этиловом спирте из расчета 0,25 мл спирта на 1 мг антибиотика; после полного растворе­ния добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы раствор содержал в 1 мл 1 мг антибиотика.

Тетрациклин и окситетрациклин растворяют в сантинормальном раст­воре соляной кислоты из расчета 1 мл на 1 мг антибиотика.

Эритромицин сначала растворяют в чистом метиловом спирте из расчета 1 мл на 10 мг эритромицина. После растворения добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы получить раствор, содержа­щий в 1 мл 1 мг антибиотика.

Исходный раствор антибиотика в количестве 2 мл вносят в первую пробирку с МПБ, перемешивают и получают определенную его концентра­цию.

Из первой пробирки 2 мл разведенного антибиотика переносят во вторую пробирку и после перемешивания переносят 2 мл в третью пробирку и т.д. до предпоследней, откуда 2 мл выливают. Последняя пробирка является контролем, в ней нет антибиотика и она свидетельству­ет о пригодности среды для роста культуры.

После разведения антибиотика во все пробирки вносят по 0,1 мл испытуемой бульонной культуры. Для этого используют 3-4-часовые или 18-часовые культуры, разведенные МПБ в 50 раз.

Пробирки помещают в термостат на 12-18 часов, но предваритель­ные результаты можно учитывать через 6-8 часов.

По истечении необходимого срока инкубации определяют максималь­ное разведение антибиотика, которое еще подавляет рост культуры. Концентрация антибиотика в последней пробирке с видимой задержкой роста и представляет собой минимальную задерживающую концентрацию антибиотика (МЗК) или минимальной подавляющей концентрацией (МПК).

Штамм считается чувствительным к антибиотикам, если МЗК препа­рата для данного штамма соответствует концентрации этого препарата, создаваемой в организме. Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл (рис. 1).