Большое значение, особенно для эффективности разделения, имеют такие характеристики сорбентов, как диаметр частиц, среднее распределение частиц по размерам и размер пор.
Основные типы сорбентов.
Силикагель - полярный адсорбент, содержит активные силанольные и силоксановые группы, его применяют для разделения соединений различной полярности.
Оксид алюминия - полярный адсорбент с гетерогенной поверхностью, содержит активные ОН - группы, обладает заметно выраженными протоноакцепторными свойствами; его применяют для разделения ароматических углеводородов, алкалоидов, хлоруглеводородов, стероидов.
Флоросил - основной силикат магния, занимает промежуточное положение между оксидом алюминия и силикагелем; удобен для разделения флавоноидов, стероидов и ацетилированных углеводородов.
Полиамиды - группа полярных сорбентов со смешанным механизмом разделения: карбоксамидная группа ответственна за адсорбционный механизм, метиленовые звенья - за распределительный механизм.
Эти сорбенты применяют для разделения флаваноидов, танинов, нитрофенолов, спиртов, кислот.
Модифицированные силикагели с привитыми группами (амино-, циано-, диол-), отличными по полярности.
Важной характеристикой сорбента является его активность, она зависит от содержания воды и понижается при увеличении содержания воды в сорбенте.
Для успешного разделения смесей веществ большое значение имеет выбор сорбента. В первую очередь нужно исходить из свойств разделяемых соединений: их растворимости (гидрофильности, гидрофобности), содержания и характера функциональных групп.
Насыщенные углеводороды адсорбируются слабо или совсем не адсорбируются на силикагелях и оксиде алюминия.
Введение двойных связей, особенно сопряженных, увеличивает адсорбционную способность соединений.
Функциональные группы в еще большей степени усиливают способность веществ к адсорбции.
Адсорбционная способность функциональных групп возрастает в следующем порядке [3]:
CH=CH<OCH3<COOR<C=O<CHO<SH<NH2<OH<COOH.
Растворители, применяемые в тонкослойной хроматографии, должны быть чистыми и осушенными. Смеси веществ могут разделяться с помощью одного растворителя, однако обычно применяют системы, состоящие из двух, трех и даже четырех растворителей.
Выбор растворителей определяется их элюирующей способностью, которая зависит от полярности растворителя, а также его протонодонорных и протоноакцепторных свойств.
Характеристика элюирующей способности наиболее важных для ТСХ растворителей приведена в таблицах 1 и 2 [3].
Для каждой новой пластинки систему растворителей следует готовить заново, так как в ней соотношение компонентов после хроматографирования изменяется.
Таблица 2 Значения силы растворителя для неполярных фаз
|
Группа (по Снайдеру) |
Растворитель |
Si |
|
|
II III IV |
Вода Метанол 2-пропанол Тетрагидрофуран Ацетонитрил |
0 2,6 3,9 4,5 3,2 |
Существенную роль при разделении веществ с помощью тонкослойной хроматографии играет количество наносимой смеси, оно влияет и на величину Rf и на разрешение пятен.
Пробы испытуемых веществ массой от 0,1 до 50 мкг, наносят на пластинку в виде растворов в эфире, хлороформе или другом летучем растворителе.
Таблица 3 Значения силы растворителя для полярных фаз
|
Группа (по Снайдеру) |
Растворитель |
Si |
|
|
I II III IV V VI VII VIII |
н-Гексан н-бутиловый эфир Изопропиловый эфир 1-Бутанол 2-Пропанол 1-Пропанол Этанол Метанол Тетрагидрофуран Пиридин Метоксиэтанол Диметилформамид Ледяная уксусная кислота Формамид Дихлорметан 1,2-дихлорэтан Этилацетат Диоксан Толуол Нитробензол Хлороформ Нитрометан Вода |
0 2,1 2,4 3,9 3,9 4,0 4,3 5,1 4,0 5,3 5,5 6,4 6,0 9,6 3,1 3,5 4,4 4,8 2,4 4,4 4,1 6,0 10,2 |
Природа растворителя может влиять на размер пятна наносимой пробы.
При нанесении пробы необходимо, чтобы: растворитель легко удалялся со стартовой зоны, и растворимость анализируемых веществ была бы не менее 0,01г/мл. Пробы наносят в виде точки или полоски длиной 5-7 мм при помощи капилляра, пипетки на 0,1 мл или микрошприца, предварительно отметив стартовую линию на расстоянии 1,5 см от края пластинки. Расстояние между отдельными пробами должно быть не менее 1 см.
После этого ждут, когда растворитель испарится, затем пластинку опускают в разделительную камеру с выбранной подвижной фазой.
В зависимости от того, в каком направлении поступает растворитель на пластинку, различают методы восходящей, нисходящей и горизонтальной хроматографии.
После разделения веществ необходимо обнаружить их на хроматограмме.
Для обнаружения бесцветных веществ, в первую очередь, следует воспользоваться физическими методами, основанными на поглощении света и флуоресценции.
Для обнаружения веществ, поглощающих в УФ-области спектра, часто применяют пластинки со слоем сорбента, содержащим флуоресцирующее вещество или опрыскивают хроматограмму после разделения смеси раствором флуоресцирующего вещества.
При облучении пластинки УФ-излучением вещества, поглощающие в этой области спектра, обнаруживаются в виде тёмных зон (пятен).
Флуоресцировать в УФ-свете способно значительное количество веществ, полученные пятна имеют при этом различный оттенок.
Для обнаружения флуоресцирующих веществ или веществ, поглощающих в УФ-области спектра, используют источники света с максимумами излучения в области 254 и 365 мкм.
Помимо оптических методов обнаружения веществ, применяют химические методы проявления хроматограмм.
К химическим методам относится использование «универсальных реагентов» и реагентов, избирательно реагирующих с определенными функциональными группами определяемых соединений.
Для количественной оценки содержания веществ в хроматографических зонах используют различные методы [2, 3]:
1. Определение с удалением хроматографической зоны с пластинки можно проводить двояким образом: переносом хроматографической зоны вместе с сорбентом либо экстрагированием хроматографической зоны со слоя сорбента.
2. Определение соединений непосредственно на пластинке методом визуального сравнения размеров площадей пятен и их окраски с соответствующими параметрами пятен стандартных образцов.
3. Метод денситометрии, повышающий точность результатов определения, основан на сканировании хроматограмм в видимом и УФ-свете с помощью «хроматографических спектрофотометров» - денситометров. Денситометры позволяют измерять поглощение света веществом на хроматограмме в режиме пропускания или отражения, а также флуоресценцию и её тушение. Режим пропускания доступен, если только исследуемое вещество имеет полосу поглощения в видимой области спектра.
В УФ-области регистрацию в режиме пропускания осуществить нельзя из-за собственного поглощения силикагеля и подложки хроматограммы.
4. Метод видеоденситометрии - сравнительно новый метод для количественной обработки хроматограмм.
Принцип метода заключается во введении изображения хроматограммы в компьютер с помощью видеокамеры или цифровой камеры с последующим сравнением интенсивностей пятен стандартных и определяемых соединений. Видеоденситометр включает осветительный блок, видеокамеру с платой видеоввода или сканер, персональный компьютер с установленной операционной системой Windows и соответствующим программным обеспечением.
Программа обработки хроматографических данных позволяет выполнять следующие функции: вводить изображения хроматограмм и сохранять их с высоким качеством и разрешением; выделять на введённом изображении хроматограммы рабочий участок, на котором будет производиться дальнейшая обработка изображения; производить автоматический или ручной поиск пятен; проводить обработку пятен, переводить их в форму хроматографических пиков, рассчитывать значения Rf и площади пиков; измерять содержание вещества в анализируемых пятнах (в относительных единицах); вводить значения концентраций для построения градуировочных зависимостей: линейной интерполяцией; линейной аппроксимацией более чем, через две точки; квадратичной интерполяцией; автоматически вычислять содержание вещества в анализируемых пятнах по введенным калибровочным значениям; представлять результаты в виде печатных документов.
5. Денситометрия с планшетным сканером с программным обеспечением для обработки хроматограмм практически не отличающимся от стандартных программ, применяемых для видеоденситометров, но существенно меньшей стоимости. При этом сканирование дает более четкое изображение хроматографических зон, что можно объяснить пониженным влиянием неравномерности освещения анализируемых объектов, чем в случае видеоденситометра.
2.2.2 Применение метода
Универсальность и доступность метода тонкослойной хроматографии сделали последний одним из ведущих методов фармацевтического анализа.
Определение подлинности пармидина в таблетках [4]. Методика. Навеску порошка растертых таблеток, эквивалентную 0,1 г пармидина, встряхивают в течение 3 минут с 20 мл спирта метилового и фильтруют.
0,002 мл полученного фильтрата (10 мкг пармидина) наносят на пластинку со слоем силикагеля F254. Рядом в качестве свидетеля наносят 0,002 мл (10 мкг) 0,5% раствора пармидина стандарта в спирте метиловом. Пластинку подсушивают на воздухе, помещают в камеру со смесью растворителей хлороформ - спирт метиловый (15 : 2) и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт подвижной фазы дойдет до конца пластинки, ее вынимают из камеры, подсушивают на воздухе и просматривают в УФ свете при 254 нм.
Определение подлинности компонентов таблеток «Пенталгин ICN» [5](состав на одну таблетку: анальгина - 0,3 г; парацетамола - 0,3 г; кофеина - 0,05 г; кодеина фосфата 0,008 г; фенобарбитала - 0,01 г).
Методика. 0,2 г порошка растертых таблеток помещают в коническую колбу с притертой пробкой, прибавляют 0,1 мл спирта и 4 мл хлороформа и встряхивают в течение 3 минут, фильтруют через бумажный фильтр. 0,005 мл полученного раствора наносят на линию старта пластинки Kieselgel 60 F254 «Merck» размером 5 ??15 см. Рядом наносят 0,005 мл раствора свидетелей (~ 20 мкг парацетамола, ~ 15 мкг анальгина, ~ 12,5 мкг кофеина, ~ 2,5 мкг фенобарбитала, ~ 2 мкг кодеина фосфата).
Пластинку подсушивают на воздухе в течение 10 минут и помещают в предварительно насыщенную камеру со смесью растворителей: ацетон - толуол - диэтиламин (19,5 : 5 : 0,5). Когда фронт подвижной фазы дойдет до линии финиша, ее вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 10 минут и просматривают в УФ- свете при 254 нм. Пятна на хроматограмме вытяжки из препарата по интенсивности окраски и положению должны соответствовать пятнам на хроматограмме раствора свидетелей.
Метод тонкослойной хроматографии незаменим также при анализе чистоты лекарственных веществ и препаратов.
Мицеллярная ТСХ анализе веществ. В работе [7] предлагают использовать такую разновидность ТСХ как мицеллярная ТСХ для определения 4-аминобутановой кислоты в таблетках алендроната натрия.
Для определения 4-аминобутановой кислоты в данной смеси необходимо было выбрать растворитель для приготовления пробы, в котором растворимость лактозы, входящей в состав таблеток, минимальна, и скорректировать состав подвижной фазы для лучшего разделения веществ и получения приемлемой формы хроматографического пятна [7].
Лактоза практически нерастворима в 96 % этаноле и метаноле, в то время как и алендронат натрия, и 4-аминобутановая кислота в этаноле достаточно хорошо растворимы. Это и определило выбор растворителя для приготовления стандартных и испытуемых растворов.
Кроме того, использование спиртов ускоряет процесс нанесения веществ на пластинку (быстро испаряется в токе воздуха), и пятна в точке нанесения получаются компактными.
В дальнейшем при хроматографировании это уменьшает размывание хроматографических зон [7].
Оптимальный состав подвижной фазы с точки зрения величины Rf 4-аминобутановой кислоты, формы хроматографических пятен и времени хроматографирования является водный раствор Бридж-35 с молярной концентрацией 0.005 моль/л, доведенный до рН 2.0 хлористоводородной кислотой. Такой состав подвижной фазы использовался в дальнейших исследованиях и при валидации методики количественного определения 4-аминобутановой кислоты в таблетках «Алендронат натрия».
На рис. 3 представлены хроматограммы определения 4-аминобутановой кислоты в таблетках «Алендроната» с использованием разных подвижных фаз.
Рис. 3. Хроматограмма определения 4-амино-бутановой кислоты в таблетках «Алендроната натрия» с использованием: А) подвижной фазы 1-бутанол: уксусная кислота:вода (6:2:2) и (Б) 0.02 М ЦПХ, 0.05 М Бридж 35, 5.0% (об) этанол, рН=2 (HCl). 1 - 4-аминобутановая кислота; 2 - таблетки «Алендронат натрия» с добавкой 4-аминобутановой кислоты