Культура клеток - это клетки из органа животного или человека, которые живут и размножаются вне организма в питательном растворе (в среде 199 или в среде Хенкса). Культивирование в культуре клеток - один из наиболее распространенных методов в вирусологии. Чаще всего применяются однослойные культуры клеток, прикрепленные к стенкам пробирок или плоских флаконов. Различают несколько типов культур.
1) первично-трипсинизированные, которые получают, обрабатывая трипсином исходную ткань, например, почки обезьян, или эмбриональную ткань человека. Культура клеток используется однократно.
2) перевиваемые культуры клеток способны размножаться при многократных посевах на свежие питательные среды. Они могут поддерживаться в лаборатории путем постоянных пересевов в течение десятков лет. Во многих лабораториях применяются перевиваемые культуры, полученные из раковой ткани человека: HeLa, ИЕр-2 и др.
3) полуперевиваемые культуры клеток - это, например, диплоидные клетки из фибробластов человеческого эмбриона, способные размножаться в течение 40-50 пассажей (пересевов), сохраняя исходный диплоидный набор хромосом.
Обнаружение вирусов в культуре клеток. Вирусы в культуре клеток обнаруживаются по цитопатическому действию (ЦПД), которое вызывают многие вирусы, например, вирус полиомиелита. ЦПД проявляется в дегенерации и разрушении клеток, или в формировании многоядерных клеток.
ЦПД можно обнаружить по цветной пробе. Для этого используют клетки, помещенные в питательную среду с индикатором, например, метиловым красным. При размножении незараженных клеток образуются кислые продукты метаболизма, и индикатор меняет цвет на желтый. Если клетки заражены вирусом, происходит нарушение нормального метаболизма клеток, и цвет среды не меняется.
Репродукцию вируса в клетке можно обнаружить и по образованию внутриклеточных включений.
Для подсчета количества вирионов используют метод бляшек. Клеточный монослой, покрытый тонким слоем агара, в плоском флаконе, заражают вирусом и по количеству бляшек или "стерильных пятен" подсчитывают количество вирионов. Считается, что одна бляшка образуется при размножении одного вириона.
Репродукцию вируса в клетке можно обнаружить также по реакции гемадсорбции. Это вариант реакции гемагглютинации. Эритроциты, внесенные в культуру клеток, адсорбируются на поверхности клеток, зараженных вирусом. Реакцию применяют, например, для обнаружения вируса гриппа.
16. Принципы классификации вирусов. Репродукция вирусов (фазы взаимодействия с клеткой хозяина)
Принципы классификации вирусов:
Вирусы составляют царство Vira, которое подразделено по типу нуклеиновой кислоты на два подцарства -- рибовирусы и дезоксирибовирусы. Подцарства делятся на семейства, которые в свою очередь подразделяются на роды. Понятие о виде вирусов пока еще четко не сформулировано, так же как и обозначение разных видов.
В качестве таксономических характеристик первостепенное значение придается типу нуклеиновой кислоты и ее молекулярно-биологическим признакам: двунитевая, однонитевая, сегментированная, несегментированная, с повторяющимися и инвертированными последовательностями и др. Однако в практической работе прежде всего используются характеристики вирусов, полученные в результате электронно-микроскопических и иммунологических исследований: морфология, структура и размеры вириона, наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида), антигены, устойчивость к высокой температуре, рН, детергентам и т. д.
В настоящее время вирусы человека и животных включены в состав 18 семейств. Принадлежность вирусов к определенным семействам определяется типом нуклеиновой кислоты, структурой, целостностью или фрагментацией генома, а также наличием или отсутствием внешней оболочки. При определении принадлежности к семейству ретровирусов обязательно учитывается наличие обратной транскриптазы.
Репродукция вирусов
Вирусы не способны размножаться на питательных средах - это строгие внутриклеточные паразиты. Более того, в отличие от риккетсий и хламидий, вирусы в клетке хозяина не растут и не размножаются путем деления. Составные части вируса - нуклеиновые кислоты и белковые молекулы синтезируются в клетке хозяина раздельно, в разных частях клетки - в ядре и в цитоплазме. При этом клеточные белоксинтезирующие системы подчиняются вирусному геному, его НК.
Репродукция вируса в клетке происходит в несколько фаз:
- Первая фаза - адсорбция вируса на поверхности клетки, чувствительной к данному вирусу.
- Вторая фаза - проникновение вируса в клетку хозяина путем виропексиса.
- Третья фаза - «раздевание» вирионов, освобождение нуклеиновой кислоты вируса от суперкапсида и капсида. У ряда вирусов проникновение нуклеиновой кислоты в клетку происходит путем слияния оболочки вириона и клетки-хозяина. В этом случае вторая и третья фазы объединяются в одну.
В зависимости от типа нуклеиновой кислоты этот процесс совершается следующим образом.
ДНК-содержащие (ДНК --> иРНК -->белок):
1. Репродукция происходит в ядре: аденовирусы, герпес, паповавирусы. Используют ДНК-зависимую РНК - полимеразу клетки.
2. Репродукция происходит в цитоплазме: вирусы имеют свою ДНК-зависимую РНК полимеразу.
РНК-содержащие вирусы:
1. Рибовирусы с позитивным геномом (плюс-нитиевые): пикорна-, тога-, коронавирусы. Транскрипции нет.
РНК -->белок
2. Рибовирусы с негативным геномом (минус- нитевые): грипп, корь, паротит, орто-, парамиксовирусы.
(-)РНК --> иРНК --> белок (иРНК комплементарная (-)РНК). Этот процесс идет при участии специального вирусного фермента - вирионная РНК-зависимая PHK-полимераза ( в клетке такого фермента быть не может).
3. Ретровирусы
(-)РНК -> ДНК --> иРНК -->белок (и РНК гомологична РНК). В этом случае процесс образования ДНК на базе (-)РНК возможен при участии фермента - РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы)
- Четвертая фаза - синтез компонентов вириона. Нуклеиновая кислота вируса образуется путем репликации. На рибосомы клетки транслируется информация вирусной иРНК, и в них синтезируется вирус-специфический белок.
- Пятая фаза - сборка вириона. Путем самосборки образуются нуклеокапсиды.
- Шестая фаза - выход вирионов из клетки. Простые вирусы, например, вирус полиомиелита, при выходе из клетки разрушают ее. Сложноорганизованные вирусы, например, вирус гриппа, выходят из клетки путем почкования. Внешняя оболочка вируса (суперкапсид) формируется в процессе выхода вируса из клетки. Клетка при таком процессе на какое-то время остается живой.
Описанные типы взаимодействия вируса с клеткой называются продуктивными, так как приводят к продукции зрелых вирионов.
Иной путь - интегративный - заключается в том, что после проникновения вируса в клетку и "раздевания" вирусная нуклеиновая кислота интегрирует в клеточный геном, то есть встраивается в определенном месте в хромосому клетки и затем в виде так называемого прови-руса реплицируется вместе с ней. Для ДНК- и РНК-содержащих вирусов этот процесс совершается по-разному. В первом случае вирусная ДНК интегрирует в клеточный геном. В случае РНК-содержащих вирусов вначале происходит обратная транскрипция: на матрице вирусной РНК при участии фермента "обратной транскриптазы" образуется ДНК, которая встраивается в клеточный геном. Провирус несет дополнительную генетическую информацию, поэтому клетка приобретает новые свойства. Вирусы, способные осуществить такой тип взаимодействия с клеткой, называются интегративными. К интегративным вирусам относятся некоторые онкогенные вирусы, вирус гепатита В, вирус герпеса, вирус иммунодефицита человека, умеренные бактериофаги.
Кроме обычных вирусов, существуют прионы - белковые инфекционные частицы, не содержащие нуклеиновую кислоту. Они имеют вид фибрилл, размером до 200 нм. Вызывают у человека и у животных медленные инфекции с поражением мозга: болезнь Крейтцфельда-Якоба, куру, скрепи и другие.
17. Фаги (вирусы микробов): морфология и ультраструктура. Фазы взаимодействия вирулентного и умеренного фагов с бактериальной клеткой. Определение активности (титра) бактериальной клетки. Профаг. Фаготипирование микроорганизмов, значение. Практическое использование фагов
Явление бактериофагии открыл и изучил французский микробиолог д'Эррель. В 1917 г. он наблюдал лизис культуры бактерий дизентерии после внесения в нее фильтрата испражнений больного, выздоравливающего от дизентерии. При многократных пассажах, то есть переносе из одной культуры в другую, фильтраты сохраняли свою лизирующую активность и даже усиливали ее. Ученый сделал из этого правильный вывод о том, что лизирующий агент - живой и при пассажах размножается в бактериях. Д'Эррель назвал этот агент бактериофагом (лат. phagos -пожирающий), а само явление лизиса - бактериофагией.
Позже было подтверждено, что бактериофаг - живой. Это вирус бактерий, он размножается в бактериях, вызывая их лизис. Добавление бактериофага в культуру бактерий на жидкой питательной среде вызывает просветление среды. На плотных питательных средах при посеве смеси бактерий и бактериофага на фоне сплошного роста бактерий появляются стерильные пятна или негативные колонии фагов.
Бактериофаги специфичны, то есть лизируют определенные виды бактерий. Отсюда их названия: дизентерийный бактериофаг, стафилококковый бактериофаг. Обнаружены фаги не только бактерий, но и актиномицетов.
В практической медицине бактериофаги нашли применение как лечебные и профилактические средства,
Важное значение имеет то, что на примере бактериофагии были открыты и изучены многие проблемы общей вирусологиии и молекулярной генетики.
Структура бактериофагов
Размеры бактериофагов колеблются от 20 нм до 200 нм. Как все вирусы, содержат ДНК, или РНК, и белковый капсид. Чаще всего встречаются и лучше изучены бактериофаги, имеющие форму сперматозоида или головастика. Состоят они из головки, хвостового отростка, батальной пластинки с короткими шинами и хвостовыми нитями. Внутри головки располагается спирально скрученная пить ДНК, покрытая белковым капсидом. Хвостовой отросток - что полый цилиндрический стержень, окруженный сократительным чехлом. Базальная пластинка и нити осуществляют процесс адсорбции бактериофага на бактериальной клетке. Существуют бактериофаги, имеющие другое строение: с короткими отростком, с отростком без сократительного чехла, без отростка, нитевидной формы.
Взаимодействие бактериофага с бактериальной клеткой
Как все вирусы, бактериофаги не размножаются на питательных средах. Их размножение происходит только в чувствительных к ним бактериальных клетках, в процессе взаимодействия, в котором наблюдаются те же фазы, что при взаимодействии других вирусов с клеткой.
Адсорбция бактериофага. Как все вирусы, фаги неподвижны, и столкновение с бактерией происходит случайно, затем адсорбция становится прочной, если у клетки имеются на поверхности фагоспецифические рецепторы. Фаги, имеющие сократительный чехол, адсорбируются с помощью хвостового отростка.
Внедрение фага внутрь клетки. Под действием фермента лизоцима, который находится в хвостовом сегменте, в клеточной стенке бактерии образуется отверстие. Через это отверстие в результате сокращения хвостового чехла внутрь бактериальной клетки переходит ДНК фага. Белковый капсид остается снаружи.
Синтез ДНК и белка бактериофага. В клетке прекращается синтез бактериальных белков. Образуются фаговые ДНК, а на рибосомах бактерий синтезируются молекулы фагового белка.
Формирование фага. Сборка зрелых фагов из ДНК и капсида происходит в цитоплазме клетки. Выход зрелых фагов из клетки происходит при разрушении бактерий с помощью лизоцима, а затем зрелые фаги внедряются в новые клетки.
"Урожай" фага, в зависимости от его вида, составляет от 20 до 200 частиц. Весь цикл взаимодействия, занимающий от 10 минут до нескольких часов, называется литическим циклом, а фаг при таком взаимодействии - вирулентным.
В отличие от вирулентных, умеренные фаги не лизируют бактерии. Их геном, проникнув в клетку, встраивается в хромосому бактерии и в дальнейшем остается в хромосоме в виде профага и реплицируется вместе с ней. Бактерии, несущие профаг, называются лизогенными, а само явление - лизогенией. Лизогенные бактерии встречаются очень часто. Профаг, находясь в геноме бактерии, придает ей какие-либо новые свойства. Так, например, продукция экзотоксина у палочек дифтерии и ботулизма связана с наличием профага.
В определенных условиях (воздействия температуры, химических веществ и др.) профаги могут превратиться в вирулентные бактериофаги. Размножаясь, они лизируют бактерии и могут переходить в другие бактериальные клетки. При выходе из хромосомы профаг может захватить соседние гены бактериальной хромосомы и при заражении другой бактерии, встроившись в ее хромосому, передать эти гены. Передача генетического материала от одной бактерии к другой с помощью умеренного бактериофага называется трансдукцией. Таким образом, могут передаваться такие признаки, как устойчивость к антибиотикам, способность продуцировать какие-либо ферменты. Умеренные бактериофаги применяются в генетической инженерии в качестве вектора - переносчика генов.