ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России
Локальная и системная продукция 47 цитокинов у пациентов с продвинутыми стадиями первичной открытоугольной глаукомы
Балацкая Н.В., Петров С.Ю., Котелин В.И., Куликова И.Г.
Цель исследования: проведение скрининга 47 цитокинов различного биологического действия в сыворотке крови (СК), в слёзной и внутриглазной жидкостях (ВГЖ) пациентов с продвинутыми стадиями первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ). Обследованы 66 человек с ПОУГ (средний возраст 65,4±8,2 года) на развитой (I группа) и далеко зашедшей (II группа) стадиях. В группу контроля вошли 25 относительно здоровых доноров (средний возраст 64,5±5,5 года); группу сравнения с целью изучения интраокулярной продукции цитокинов (в ВГЖ) при глаукоме составили 7 пациентов с возрастной незрелой катарактой (средний возраст 71,3±3,7 года). Содержание цитокинов в биоматериале определяли с помощью мультиплексного анализа на платформе хMAP (MAGPIX, «Luminex Corporation», США) в программе «xPONENT 3.1» («Luminex Corporation», США), наборами «Procarta Plex» («eBioscience», Австрия). Установлено, что продвинутые стадии глаукомы характеризуются изменениями системной продукции 10 медиаторов (IL-1RA, IL-18, RANTES/CCL5, EGF, HGF/SF, LIF, PDGF-BB, SCF, VEGF-A, TGF-Я2) и в значительной степени сопровождаются локальными сдвигами большинства цитокинов, обладающих различными биологическими эффектами (IL-1Я, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-18, IL-27, TNFa, GRO-a/CXCL1, IL-8/CXCL8, IP-10/CXCL10, MIP-1Я/CCL4, RANTES/CCL5, Eotaxin/CCL11, GM-CSF, EGF, HGF/SF, LIF, PDGF-BB, SCF, TGF-Я2). Комплексный анализ широкой панели цитокинов подтвердил связь заболевания с усилением местной продукции IL-6, TNFa, IL-8/CXCL8 и TGF-Я2 и позволил выделить ряд новых медиаторов - участников деструктивно-воспалительного процесса при ПОУГ: IL-1RA, IL-4, IL-7, SDF-1a/CXCL12, Eotaxin/CCL11.
Изменения концентраций цитокинов в СК (IL-1RA, EGF) и ВГЖ (IL-1Я, IL-2, IL-4, IL-17A, IL-18, TNFa, IL-8/CXCL8, MIP-1Я/CCL4, EGF, LIF, TGF-Я2) пациентов достоверно отличаются при сравнении развитой и далеко зашедшей стадий ПОУГ, что указывает на важную роль данных медиаторов в патогенезе заболевания и на потенциальную возможность их использования в качестве биомаркеров прогрессирования глаукоматозного процесса.
Ключевые слова: первичная открытоугольная глаукома, воспаление, деструкция, цитокины, хемокины, факторы роста, биомаркеры.
Local and systemic production of 47 cytokines in patients with advanced stages of primary open-angle glaucoma
Balatskaya N.V., Petrov S.Yu., Kotelin V.I., Kulikova I.G.
Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases
Purpose of the study: screening of 47 cytokines of various biological effects in the blood serum (BS), in the lacrimal and intraocular fluids (IOF) of patients with advanced stages of primary open-angle glaucoma (POAG). We examined 66 people with POAG (average age 65.4±8.2 years) at advanced (group I) and advanced (group II) stages. The control group included 25 relatively healthy donors (mean age 64.5±5.5 years); the comparison group with the aim of studying the intraocular production of cytokines (in the intraocular fluid) in glaucoma consisted of 7 patients with age-related immature cataract (mean age 71.3±3.7 years). The content of cytokines in the biomaterial was determined using multiplex analysis on the xMAP platform (MAGPIX, Luminex Corporation, USA) using the xPONENT 3.1 software (Luminex Corporation, USA), with Procarta Plex kits (eBioscience, Austria). It was found that advanced stages of glaucoma are characterized by changes in the systemic production of 10 mediators (IL-1RA, IL-18, RANTES / CCL5, EGF, HGF / SF, LIF, PDGF-BB, SCF, VEGF-A, TGF-Я2) and a significant degrees are accompanied by local shifts of most cytokines with various biological effects (IL-1Я, IL-1RA, IL-2, IL- 4, IL-6, IL-7, IL-13, IL-15, IL-17A, IL- 18, IL-27, TNFa, GRO-a / CXCL1, IL-8 / CXCL8, IP-10 / CXCL10, MIP- 1Я / CCL4, RANTES / CCL5, Eotaxin / CCL11, GM-CSF, EGF, HGF / SF, LIF, PDGF-BB, SCF, TGF-Я2). A comprehensive analysis of a wide panel of cytokines confirmed the relationship of the disease with an increase in local production of IL-6, TNFa, IL-8 / CXCL8 and TGF-Я2 and made it possible to identify a number of new mediators - participants in the destructive inflammatory process in POAG: IL-1RA, IL-4, IL-7, SDF-1a / CXCL12, Eotaxin / CCL11. Changes in the concentrations of cytokines in BS (IL-1RA, EGF) and IOF (IL-1Я, IL- 2, IL-4, IL-17A, IL-18, TNFa, IL-8 / CXCL8, MIP-1Я / CCL4, EGF, LIF, TGF-Я2) patients significantly differ when comparing the developed and advanced stages of POAG, which indicates the important role of these mediators in the pathogenesis of the disease and the potential for their use as biomarkers of the progression of the glaucomatous process.
Keywords: primary open-angle glaucoma, inflammation; destruction, cytokines, chemokines, growth factors, biomarkers.
Введение
Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) является ведущей причиной необратимой слепоты в развитых странах. Распространенность ПОУГ в мире составляет 3,5% среди населения в возрасте от 40 до 80 лет и имеет тенденцию к значительному увеличению [1]. В Российской Федерации рост заболеваемости глаукомой и ее лидирующее положение среди причин необратимой слепоты соответствуют общемировой тенденции. В России зафиксировано свыше 1 млн больных глаукомой, из которых более 150 тыс. являются инвалидами по зрению. Почти во всех регионах страны первичная инвалидность вследствие глаукомы занимает первое место среди всех офтальмопатологий [2].
Механизмы дегенеративно-дистрофического процесса, затрагивающего при глаукоме практически все оболочки глазного яблока, крайне сложны и во многом остаются нерасшифрованными. Особое место среди них отводится нарушениям в цитокиновом звене иммунорегуляции [3], которое в настоящее время активно изучается сразу в нескольких основных аспектах: повреждение решетчатой мембраны и склеры, снижение жизнеспособности и гибели ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) и их аксонов; поражение дренажного аппарата с нарушением оттока ВГЖ, избыточное рубцевание после антиглаукоматозных операций.
В доступной литературе представлено значительное количество публикаций, посвященных оценке локальной и системной продукции цитокинов при различных стадиях ПОУГ [4]. При этом большинство работ акцентированы на исследовании узкого спектра иммуномедиаторов, обладающих провоспалительной и фибротической активностью: цитокинов иммунного ответа, отдельных хемокинов, белков семейства трансформирующего фактора роста (TGF-Я1,2,3). Приводятся доказательства нарушений в локальной продукции цитокинов, свидетельствующих о местном воспалительном процессе при ПОУГ: так, в ВГЖ пациентов c глаукомой обнаружено значительное повышение уровней IL-6, CCL2/MCP-1 [5, 6], IL-8, MIP-1Я/CCL4 [7], TNF-a [8], а также IL-12, IL-17 [6].
Однако лишь ограниченное количество научных публикаций посвящено изучению больших панелей цитокинов во внутриглазной (ВГЖ) и слёзной жидкостях (СЖ) и сопоставлению их содержания, немногочисленные работы касаются оценки локальной и системной продукции медиаторов [3].
Проведение целенаправленного комплексного исследования широкой линейки медиаторов различного биологического действия в крови и жидкостях глаза, в частности ВГЖ и СЖ, пациентов с ПОУГ представляется крайне актуальным, так как детальное понимание молекулярных механизмов патогенеза заболевания будет способствовать совершенствованию способов диагностики и разработке новых стратегий лечения глаукомы.
Цель исследования: проведение скрининга 47 цитокинов различного биологического действия в сыворотке крови, в слёзной и внутриглазной жидкостях пациентов с продвинутыми стадиями ПОУГ.
Материалы и методы исследования
В исследование включены 66 человек (66 глаз) с ПОУГ в развитой и далеко зашедшей стадиях. В I группу вошли 34 пациента (34 глаза) с ПОУГ развитой стадии. II группа включала 32 больных (32 глаза) с ПОУГ далеко зашедшей стадии. Средний возраст пациентов составил 65,4±8,2 года (от 53 до 79 лет) и был сопоставим в группах: 63,2±7,8 года (53-78 лет) в I группе и 67,7±8,2 года (53-79 лет) во II группе.
В группу контроля вошли 25 относительно здоровых доноров (25 глаз, 51-76 лет, средний возраст 64,5±5,5 года) без существенных поражений органа зрения (патологии сетчатки, глаукомы, травм и офтальмохирургических вмешательств). Допустимая сопутствующая офтальмопатология - начальная возрастная катаракта, миопия слабой степени. Соматическая патология была представлена преимущественно синдромом артериальной гипертензии, хронической ишемической болезнью сердца и межпозвонковым остеохондрозом. С целью исследования медиаторов в ВГЖ больных глаукомой была набрана группа сравнения, состоящая из 7 пациентов (7 глаз, 66-78 лет, средний возраст 71,3±3,7 года), госпитализированных в Центр для плановой операции по поводу катаракты, соответствующая критериям включения и возрастной незрелой катарактой. Мы учли, что старение хрусталика могло повлиять на концентрацию исследуемых медиаторов [9]. Согласно Федеральным клиническим рекомендациям по лечению пациентов с катарактой («Федеральные клинические рекомендации по оказанию офтальмологической помощи пациентам с возрастной катарактой». Экспертный совет по проблеме хирургического лечения катаракты. Москва. Издательство «ОФТАЛЬМОЛОГИЯ». 2020 г.), мы не имели возможности сформировать наиболее «здоровую» группу сравнения из пациентов с начальной возрастной катарактой для забора и исследования ВГЖ по причине наличия противопоказаний к проведению оперативного вмешательства больным с начальной возрастной катарактой. У исследуемых пациентов не ожидалось улучшения зрительных функций в результате проведения операции по поводу катаракты и отсутствовали другие медицинские показания для ее удаления (факогенная патология).
Всем больным проведено комплексное офтальмологическое обследование для постановки диагноза, включая визометрию, биомикроскопию, тонометрию, гониоскопию, компьютерную периметрию, офтальмоскопию.
Материалом иммунологического исследования служили образцы сыворотки крови (СК, n=91), слёзной жидкости (СЖ, n=78) и внутриглазной жидкости (ВГЖ, n=32) пациентов основных групп, группы контроля и сравнения. Всего исследована 201 тест-проба.
Взятие СК и СЖ осуществляли до каких-либо манипуляций. Забор СЖ в объеме 25-50 мкл проводили с помощью стерильной градуированной пипетки из нижнего свода конъюнктивы в микропробирку типа Эппендорф. СК получали, используя стандартные методики.
Образцы ВГЖ были собирали во время операции по поводу глаукомы (в исследуемых группах больных), сенильной незрелой катаракты (для группы сравнения) путем аспирации из передней камеры глаза через парацентез роговицы с помощью инсулинового шприца, избегая контакта иглы с радужной оболочкой, хрусталиком и эндотелием роговицы.
Забор всех биологических жидкостей проводился с согласия пациента после детального разъяснения сути выполняемых процедур и целей исследования.
До проведения анализа материал хранился при температуре -70°C. С помощью мультиплексного анализа на платформе хМАР (MAGPIX, «Luminex Corporation», США) в программе «xPONENT 3.1» («Luminex Corporation», США), наборов «Procarta Plex» («eBioscience», Австрия) в пробах определяли концентрации 45 цитокинов различного биологического действия: интерлейкинов (IL-1a, IL-1Я, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31), интерферонов (IFN-a, IFNy), факторов некроза опухолей (TNFa, TNF-Я), хемокинов (GRO-a/CXCL1, IL- 8/CXCL8, IP-10/CXCL10, SDF-1a/CXCL12, MCP-1/CCL2, MIP-1a/CCL3, MIP-1Я/CCL4, RANTES/CCL5, Eotaxin/CCL11), факторов роста (GM-CSF, NGF-Я, BDNF, EGF, FGF-2, HGF/SF, LIF, PDGF-BB, PIGF-1, SCF, VEGF-A, VEGF-D). Исследования проводились согласно инструкции производителя с учетом минимальной и максимальной границ чувствительности метода.
Исследование содержания трансформирующих факторов роста TGF-Я1 и TGF-Я2 в биоматериале выполняли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) наборами Invitrogen («Thermo Fisher Scientific, Austria»). Результаты реакции учитывали на мультифункциональном спектрофотометре Cytation 5 («Biotek») при длине волны 450 нм.
Статистический анализ результатов проведен при помощи электронных таблиц Microsoft Office Excel 2010 и пакета прикладных программ «Statistica» v. 13.0 Stat Soft Inc. (США) и SPSS 22 (IBM). Для нормально распределенных выборок были представлены среднее (М) и стандартная ошибка среднего (m). Согласованность распределения с нормальным определяли с помощью критерия Шапиро-Уилка (W). Для сравнения нормально распределенных независимых выборок использовали t-критерий Стьюдента. Различия считались значимыми в случае, если уровень значимости для соответствующих критериев составлял p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
В образцах СК доноров контрольной группы определен 21 цитокин из 47 исследуемых. В 64-100% случаев обнаружены IL-1RA, IL-7, IP-10/CXCL10, SDF-1a/CXCL12, MCP-1/CCL2, MIP-1Я/CCL4, RANTES/CCL5, Eotaxin/CCL11, BDNF, EGF, HGF/SF, LIF, PDGF-BB, PIGF-1, SCF, VEGF-A, TGF-Я1, TGF-Я2. Реже, в 28-44% тест-проб, встречались TNFa, IL-8, MIP-1a (табл. 1).
В СЖ здоровых людей выявлены 23 медиатора, из которых в подавляющем большинстве образцов (56-100%) были обнаружены IL- 1Я, IL-1RA, IL-7, GRO-a/CXCL1, IL- 8/CXCL8, IP-10/CXCL10, MCP-1/CCL2, MIP-1Я/CCL4, Eotaxin/CCLll, EGF, HGF/SF, LIF, PDGF-BB, PIGF-1, VEGF-A, TGF-Я1, TGF-Я2. Менее чем в половине случаев (20-44%) определялись IL-2, IL-15, IL-17A, SDF-1a, RANTES, GM-CSF (табл. 2).
В образцах ВГЖ группы сравнения определялись только 11 цитокинов. Высокая частота выявления в ВГЖ (86-100%) была характерна для IL-7, IP-10/CXCL10, SDF- 1a/CXCL12, MCP-1/CCL2, Eotaxin/CCL11, HGF/SF, SCF, VEGF-A, TGF-Я1, TGF-Я2. В трети случаев (29%) определялся FGF-2 (табл. 3). Остальные медиаторы были идентифицированы в незначительном количестве проб или концентрация этих веществ была ниже порога минимальной чувствительности тест-системы.
В СК пациентов I группы (со II стадией ПОУГ) были обнаружены 19 медиаторов из 47 исследуемых. С максимальной частотой (в 100% случаев) определялись следующие цитокины: IP-10/CXCL10, SDF-1a/CXCL12, MIP-1Я/CCL4, RANTES/CCL5, Eotaxin/CCL11, BDNF, HGF/SF, PDGF-BB, PIGF-1, VEGF-A, TGF-Я1, TGF-Я2. В 35-91% проб выявлены IL-7, IL-18, MCP-1/CCL2, EGF, LIF, SCF. Несколько реже, у 18% пациентов, в СК определялся TNFa (табл. 1).
Анализ уровней системной продукции цитокинов показал достоверное увеличение концентрации содержания IL-18, SCF, VEGF-A и снижение содержания RANTES/CCL5, EGF, HGF/SF, LIF, PDGF-BB, TGF-Я2 в СК относительно таковых в группе контроля (p<0,05).
В СЖ больных с развитой стадией ПОУГ (I группа) были выявлены 26 цитокинов из 47 исследуемых. Чаще, в 67-100% тест-проб, определялись IL-7, GRO-a/CXCL1, IL-8/CXCL8, IP- 10/CXCL10, SDF-1a/CXCL12, MCP-1/CCL2, MIP-1Я/CCL4, RANTES/CCL5, Eotaxin/CCL11, EGF, HGF/SF, LIF, PDGF-BB, VEGF-A, TGF-Я1, TGF-Я2. В 26-50% случаев обнаруживались IL-1Я, IL-1RA, IL-2, IL-6, IL-15, IL-17A, TNF-a, GM-CSF, PIGF-1, SCF (табл. 2).
В данной группе отмечены достоверные изменения показателей локальной продукции цитокинов относительно значений нормы: увеличение содержания IL-1Я, IL-2, IL-6, IL-15,
TNF-a, MIP-1Я/CCL4, EGF, SCF, TGF-Я2 и снижение концентрации PDGF-BB в СЖ пациентов (p<0,05). Также отмечалась тенденция к усилению секреции IL-1RA в СЖ по сравнению с таковой в контроле (p=0,06).
Необходимо отметить, что такие цитокины, как IL-2, SDF-1a/CXCL12 и RANTES/CCL5, статистически значимо чаще встречались в СЖ пациентов, чем в группе здоровых обследуемых (p<0,05).
В образцах ВГЖ больных I группы (развитая ПОУГ) выявлены 18 медиаторов из 47 исследуемых. В 100% проб определены: IL-7, IP-10/CXCL10, SDF-1a/CXCL12, MCP-1/CCL2, Eotaxin/CCL11, HGF/SF, SCF, VEGF-A, TGF-Я1, TGF-Я2. В 33% случаев определены IL-1RA, IL-2, IL-6, IL-13, GRO- a/CXCL1, IL-8/CXCL8, EGF, FGF-2 (табл. 3).