Материал: Лаба КЭФ

Далее необходимо составить программу анализа. В программу анализа вносят этапы промывки и кондиционирования капилляра, отбор проб и условия анализа. Время анализа для первого (самого щелочного) раствора ведущего электролита устанавливают 8 минут. Анализ останавливают, если на ЭФГ появился второй пик. Полученная ЭФГ сохраняется в папке, предварительно указанной в программе анализа. После получения первой ЭФГ меняют пробирки с буферными растворами и проводят анализ пробы рифабутина с новым раствором ведущего электролита. Следует иметь в виду, что, чем кислее используемый раствор ведущего электролита, тем медленнее ЭОП и время выхода пиков увеличивается. Таким образом, анализ повторяют со всеми буферными смесями, меняя каждый раз пробирки с буферными растворами в автосемплере. В ходе выполнения анализа следят за порядком появления пиков. На каждой ЭФГ должно быть по 2 пика. Возможен случай,

когда пики не будут достаточно разрешены.

После выполнения четырех анализов и получения ЭФГ нормального качества открывают все полученные ЭФГ в одном пакете. Сопоставляя времена выхода пиков рифабутина и метки ЭОП и последовательность их выхода, делают вывод об изменении заряда ионной формы RB в зависимости от кислотности раствора ведущего электролита.

Все полученные в ходе выполнения ЭФГ вклеивают в лабораторный журнал. Выводы о ионном состоянии молекулы рифабутина при различных рН и участии в равновесии различных ионных групп молекулы обосновывают,

используя значения ступенчатых констант кислотности рифабутина.

Работа 2. Определение кофеина и теобромина в водном

экстракте чая (кофе) методом мицеллярной

электрокинетической хроматографии

Кофеин и теобромин являются алкалоидами пуринового ряда, их структурные формулы приведены на рис.___.

Рис. 1. Структурные формулы кофеина и теобромина

Обе молекулы остаются нейтральными в широком диапазоне рН водных растворов. По этой причине количественное определение этих веществ методом КЭ выполняют с применением мицеллярной электрокинетической хроматографии. В буферный раствор ведущего электролита добавляют анионный ПАВ (додецилсульфат натрия (ДДС)) в концентрации,

превышающей критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ).

Попадая в капилляре в мицеллярную среду, молекулы алкалоидов включаются в отрицательно заряженные мицеллы ДДС, образуя так называемую псевдостационарную мицеллярную фазу. Отрицательный поверхностный заряд мицелл обеспечивают регистрацию пиков алкалоидов в анионной области на электрофореграмме (ЭФГ).

Цель лабораторной работы: Определить содержание кофеина и теобромина в водном экстракте чая (или кофе).

Для этого следует:

-приготовить двухкомпонентные градуировочные растворы, содержащие кофеин и теобромин в различных концентрациях;

-приготовить раствор ведущего электролита;

-получить ЭФГ градуировочных растворов и провести калибровку по кофеину и теобромину;

-приготовить водный экстракт чая (или кофе), получить его ЭФГ и определить количественное содержание кофеина и теобромина в водном экстракте с использованием построенных градуировочных графиков.

Используемое оборудование и условия КЭ

Оборудование. В эксперименте по КЭФ используется система капиллярного электрофореза «Капель 105М» («Люмэкс», Россия), оборудованная спектрофотометрическим детектором и кварцевым капилляром (внутренний диаметр 75 мм, эффективная длина 50 см, общая длина 60 см). Применяется программноеобеспечение «Эльфоран» («Люмэкс», Россия).

Растворы центрифугируют с использованием лабораторной центрифуги

MiniSpin, Eppendorf.

Весы аналитические.

Посуда: колбы мерные, 100 мл и 25 мл; стаканчики стеклянные, 25 мл; пипетки и дозаторы, пластиковые пробирки 1,5 мл, флаконы стеклянные пенициллиновые.

Реагенты и растворы:

Растворы для промывки капилляра: 1н HCl и 0,5 н NaOH.

Сухие соли для приготовления ведущих электролитов: Na2B4O7·10 H2O и ДДСН (С12Н25SO4Na).

Условия КЭ: капилляр термостатировать при 25°С;

напряжение, подаваемое на капилляр +25 кВ;

длина волны детектирования 254 нм;

ввод пробы гидродинамический (30 мБар, 5 секунд).

После каждого анализа капилляр промывают рабочим буферным раствором в течение 3 минут.

Выполнение работы

Промывка и кондиционирование капилляра

Включают прибор. Проводят промывку капилляра (см. стр___).

Приготовление буферного раствора для заполнения капилляра

Состав буферного раствора для заполнения капилляра: 20мМ водный раствор тетрабората натрия + 40 мМ додедилсульфата натрия. Раствор готовят в мерной колбе объемом 25 мл. Необходимые для приготовления навески веществ взвешивают в пенициллиновых флаконах на аналитических весах и вносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой объем раствора в колбе до метки и перемешивают его до полного растворения компонентов.

Далее, буферным раствором заполняют 3 пробирки типа «Эпендорф», внося дозатором в каждую по 500 мкл раствора. Перед применением буферные растворы следует дегазировать центрифугированием при 12000 об/мин, 20°С, 5 мин (центрифуга Eppendorf). Следует помнить, что в центрифугу можно устанавливать пробирки только так, чтоб они уравновешивали друг друга.

После центрифугирования пробирки устанавливают в карусель автосемплера:

две слева (в 9 и 10 гнездо), одну справа в 10 гнездо.

Приготовление градуировочных растворов

Необходимо приготовить 3 двухкомпонентне градуировочных раствора,

содержание кофенина и теобромина в них приведено в таблице___.

Содержание кофеина и теобромина в градуировочных растворах Таблица___.

Раствор смеси 1 готовят по точным навескам компонентов в мерной колбе объемом 100 мл. Необходимые навески теобромина и кофеина взвешивают на аналитических весах в сухих пенициллиновых флаконах с точностью до четвертого знака после запятой. Смесь 2 и 3 готовят последовательным разбавлением из раствора смеси 1. Теобромин необходимо растворять в горячей воде. При приготовлении раствора смеси 1 сначала в мерную колбу количественно переносят взвешенную навеску теобромина и заполняют колбу на 2/3 ее объема горячей дистиллированной водой (70-80 С). Добиваются полного растворения теобромина, перемешивая раствор в колбе круговыми движениями. После этого в колбу вносят нужную навеску кофеина и после охлаждения раствора в колбе до комнатной температуры доводят объем в колбе до метки, закрывают пробкой и хорошо перемешивают раствор.

Смеси 2 и 3 готовят разбавлением смеси 1, не забывая хорошо перемешать приготовленные растворы. Далее приготовленные растворы отбирают дозатором (по 500 мкл) и вносят в пробирки «Эппендорф». Отрезают ножницами крышки пробирок и вставляют пробирки с градуировочными смесями в гнезда автосемплера слева (в грезда 1, 2 и 3).

Приготовление анализируемых проб чая или кофе и проведение КЭ

Чай (Кофе). Взвешенную на аналитических весах навеску чая (кофе),

необходимую для приготовления чашки напитка, переносят в мерный стакан

изаливают кипящей дистиллированной водой. Раствор в стакане перемешивают, используя магнитную мешалку. После охлаждения раствора отбирают по 1 мл раствора в пробирки («Эпендорф») дозатором. Необходимо помнить, что в центрифугу можно устанавливать пробирки только таким образом, чтоб они друг друга уравновешивали. Растворы в пробирках центрифугируют при 12000 об/мин, 20°С, 5 мин. При необходимости проводят повторное центрифугирование. Для этого из отцентрифугированной первый раз пробирки аккуратно дозатором отбирают 500 мкл надосадочной жидкости

ипереносят ее в чистую пробирку для повторного центрифугирования.