Используют твердые подложки.
Подложка |
+ |
- |
Фильтровальная или хроматографическая бумага |
Сниженная конвекция разделенные зоны фиксируются и красятся; Оборудование проще |
Непрозрачность; Загрязнения и неоднородность бумаги мешают разделению ; “Хвосты” из-за высокой адсорбционной емкости.; Фон окрашивается(затрудняет распознавание |
Пленки из ацетата целлюлозы |
Быстрый, требует меньшего количества пробы для анализа. Низкая адсорбционная емкость помогает избежать появления “хвостов” на электрофореграмме. После окрашивания фон остается бесцветным. |
Непрозрачность в водных растворах (можно добиться прозрачности, погрузив в минеральное масло). Дороже, чем при использовании бумаги. Мало пригоден для препаративного электрофореза. |
Крахмальный гель |
первый носитель со свойствами молекулярного сита. Активно препятствует конвекции. Повышает разрешение. |
Низкая прозрачность, хрупкость, размер пор можно менять лишь в небольших пределах. Приготовление качественного геля трудоемко |
Агарозный гель |
Удовлетворительная прозрачность, высокая пластичность (проще резать, удобнее красить и определять ферментативную активность прямо в геле), простота изготовления |
Из-за отрицательного заряда на сульфатных и СООН-группах сетки агара возникает электроосмос, приводящий к неравномерному распределению электрического поля, а иногда – гидростатического давления. Возможно химическое взаимодействие веществ с агаром |
Полиакриламидый гель |
Химически инертен, можно кипятить. Можно задать необходимый размер пор и обеспечить свойства молекулярного сита. Высокая прозрачность. Легко готовить. Упругий, прочный |
На сегодняшний день наилучший носитель, но готовится из акриламида - ядовитого вещества. Так же можно сказать, что помимо цилиндрических часто используют гели в виде тонких пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие пластины имеют важное преимущество: на них можно одновременно фракционировать несколько препаратов |
ПААГ формируют путем сополимеризации акриламида (создающего линейную “основу”) и метиленбисакриламида (служащего для поперечных “сшивок” линейных цепей).
Процесс полимеризации инициируется персульфатом, (можно применять другие инициаторы, напр., рибофлавин и свет) и катализируется тетраметилэтилендиамином (TEMED).
В результате полимеризации получаются гели ячеистой структуры, размеры пор в которых зависят от концентрации мономеров. Каждый второй углеродный атом линейной цепи содержит кислотную амидную группу, что обеспечивает гидрофильность полимера.
Гель должен состоять из агарозной пробки, разделяющего геля, концентрирующего геля и лунок.
Пробка - нужна для образования стоп-линии.
Разделяющий – нижний мелкопористый гель. В нем происходит электрофоретическое и молекулярно-ситовое разделение компонентов пробы.
Концентрирующий – крупнопористый гель. Размер пор ограничивает диффузию. Нужен для электрохимического концентрирования белков (собирает смесь белков перед переходом в разделяющий гель в одну узкую полоску).
Лунки – в них заливается образец.
ДСН – додецилсульфат натрия, анионный детергент. Он позволяет разделять белки с молек. массой от 20 до 200 кДа.(для разделения нукл. к-т среднего размера обычно применяют агарозные гели.
1. молекулы в геле могут быть окрашены с помощью бромида этидия. Молекулы будет видно за счет флуоресценции под ультрафиолетовым светом
2. После проведения электрофореза гель окрашивают Кумаси синим или серебром.
Можно использовать флуоресцентные красители SYPRO красный или SYPRO оранжевый, которые нековалентно связываются с белками. (Пятна белков, окрашенных флуоресцентными красителями, детектируют с помощью устройств с лазерным возбуждением флуоресценции).