12. Для чего нужна регуляция экспрессии гена и каким образом она осуществляется?

Регулировать экспрессию белка необходимо поскольку, экспрессия чужеродного белка может привести к гибели бактерии-хозяина, к тому же плазмиды могут утрачиваться после нескольких клеточных циклов. Экспрессия белка – это синтез белков в клетке, под контролем определенных генов. Длинный процесс с транскрипцией ДНК, получением РНК и преобразованием его в активный белок.

В биотехнологических экспрессионных системах регуляция экспрессии нужна для оптимизации роста культуры клеток с целью получения максимального количества целевого белка. В частности, бактериальные клетки в культуре без экспрессионной нагрузки демонстрируют логарифмический характер роста. Индукцию экспрессии рекомбинантного белка начинают в средней фазе роста, когда оптическая плотность клеточной культуры достигает OD600 ~ 0.6-0.7 оптических единиц. После добавления индуктора запускается процесс синтеза целевого белка, а деление клеток при этом замедляется, постепенно выходя в стационарную фазу. Если индуктор добавлять сразу, то клеток в культуре будет мало, что снизит выход белка, если же добавить в позднюю фазу роста, то при большом количестве клеток белка будет мало, так как ресурсы питательной среды уже будут истощены и их будет недостаточно для синтеза.

Для этого используются сильные регулируемые промоторы: промоторы lac- и trp-оперонов E. соli; специально сконструированный tac-промотор, включающий — 10-область lас-промотора и — 35-область trp-промотора; промотор бактериофага λ; промотор гена бактериофага Т7. С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции генов. Так, lac-оперон в отсутствии лактозы находится в репрессируемом состоянии. Включение lac-оперона или происходит при добавлении в среду лактозы или ИПТГ, т.е. возобновляется транскрипция.

Ну и еще можно упомянуть арабинозный промотор, с которым мы, собственно, и работали.

13. Что такое иптг? Что происходит в трансформированных клетках после его добавления в питательную среду?

ИПТГ – изопропил-β-D-тиогалактопиранозид – индуктор lac-оперона, который контролирует процесс транскрипции. В технологии рекомбинантных ДНК используется для индукции клонированных генов.

ИПТГ предотвращает связывание белка-репрессора с lac-опероном, что возобновляет транскрипцию, и как следствие запускает синтез нужного белка.

14. В каких отделах клетки и в какой форме может осуществляться накопление белка при экспрессии гена?

    Локализация целевого белка	Достоинства	Недостатки
    Секретироваться в культу­ральную среду (при нали­чии в экспрессионной кон­струкции лидерного пеп­тида)	Нет загрязнения клеточ­ными белками, отсутствие клеточных протеаз	Низкая концентрация целе­вого белка, большой объем культуры, требующий кон­центрирования
    Секретироваться в пе­риплазму (при наличии в экспрессионной конструк­ции лидерного пептида)	Небольшое количество балластных белков, пра­вильный фолдинг целевого белка	Маленькое количество це­левого белка из-за ограни­ченного пространства
    Накапливаться в цито­плазме клетки-хозяина в растворимой форме	Правильный фолдинг целе­вого белка, нет необходи­мости переводить белок в растворимую форму	Наличие клеточных про­теаз, большое количество балластных белков, труд­ности очистки
    Накапливаться в цито­плазме клетки-хозяина в виде нерастворимых телец включения	Высокая чистота препа­рата, легкость очистки це­левого белка	Сложности фолдинга целе­вого белка, необходимость перевода белка в раствори­мую форму

15. Ген экспрессируемого в е.Coli белка находится под промотором рнк полимеразы фага т7. Какие гены должны присутствовать в клетке-хозяине, чтобы экспрессия была эффективной?

Промотор бактериофага Т7 является сильным промотором и обеспечивает очень высокий уровень транскрипции целевых генов. Для транскрипции гена под контролем Т7 необходима РНК полимераза бактериофага T7. Данный фермент очень активен и высоко специфичен к последовательности промотора бактериофага T7. Транскрипция гена в плазмиде под управлением T7 промотора может быть запущена после синтеза T7 полимеразы ген, который встроенной в геном штамма-продуцента в виде профага (λDE3). Ген полимеразы, в свою очередь, может находиться под управлением индуцируемого промотора, такого как lac. T7 промоторы используются во многих коммерческих экспрессионных системах и включается при добавлении ИПТГ.

16. В каких условиях производится культивирование трансформированных клеток е.Coli bl21?

Клетки штамма E. coli BL21(DE3), культивировали в LB-среде, содержащей ампициллин с постоянным перемешиванием при 37°С до плотности OD590нм = 0,8. Индукцию синтеза белка проводили добавлением в культуральную среду ИПТГ (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид), и культивировали еще в течение 3-х часов в тех же условиях. Клетки осаждали центрифугированием (5000g, 20 мин, 4°С).

17. Какие преимущества и недостатки получения целевого белка в растворимой форме при экспрессии его гена в бактериальной культуре?

Экспрессия белков в растворимой форме дешевле, быстрее, так как нет проблем с фолдингом и с дополнительным растворением белка, как в случае с тельцами включения. Недостатки– нестабильность (доступность для протеаз), сложность очистки (так как есть риск повредить белок растворителем).

18. Что такое “тельца включения”? Какие преимущества и недостатки они дают при выделении рекомбинантных белков?

Тельца включения — это нерастворимые белковые агрегаты, образующиеся при суперэкспрессии (чрезмерная активность гена, который производит избыточное количество белка) рекомбинантных белков у бактерий. Под микроскопом они выглядят как большие тёмные скопления, представляют собой аморфные образования. Если синтез белка прекращается, то тельца включения постепенно исчезают и полностью свёрнутый белок появляется в цитоплазме.

При выделении рекомбинантных белков основным преимуществом телец включения является то, что они содержат относительно чистый экспрессируемый белок и сравнительно легко выделяются; стабильность (недоступность для протеаз), простота очистки и низкое содержание примесей. Однако недостаток – это последующий рефолдинг (повторное сворачивание) белка. Поэтому существуют специальные системы экспрессии, намеренно направляющие белок в тельца включения.

19. Какими растворами промывают “тельца включения” для подготовки к очистке? Для чего используется каждый этап промывки?

1. Разрушают клетки ультразвуком в буфере 20 мМ р-ре Трис-HCl, рН 7.0. Этот буфер используется для перехода содержимого в экстракт.

2. К разрушенным клеткам добавляют 0.9% NaCl. Он служит для удаления гидрофильных примесей.

3. Промывка Triton 1% X-100 – служит для удаления гидрофобных компонентов (клеточных мембран в основном)

4. Промывка буфером 20 мМ Трис-HCl pH 7.0 – для промывки телец включений от детергента;

После каждого этапа необходимо ресуспендировать образцы и после центрифугировать-осадить белок. После центрифугирования сливается супернатант (надосадочная жидкость).

5. К осадку добавляют мочевину, чтобы перевести тельца-включения в раствор. На этом этапе белок готов для очистки на хроматографической колонке.

20. Какие методы используют для разрушения бактериальных клеток?

Химические:

-обработка щелочью (дешево, изменение pH, после обработки щелочью не остается практически ни одной жизнеспособной клетки);

-органическими растворителями (дешево и легко, применяют для выделения ферментов из дрожжей, но требуется дополнительные тестирования, чтобы продукт не денатурировал);

-детергентами (детергенты дороги, в большинстве случаев в их присутствии белки денатурируют, а кроме того, они могут загрязнять конечный продукт).

Биологические:

1. Лизис (гидролиз клеточных стенок)

-Грамположительных бактерий (лизоцимом яичного белка);

-Грамотрицательных бактерий (лизоцимом и этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА));

-Дрожжей (одним или несколькими ферментами: β-1,3-глюканазы, β-1,6-глюканазы, манназы и хитиназы).

2. Ферментативная обработка (с применением рекомбинантных микроорганизмов для промышленного синтеза ферментов)

Физические

-немеханическими (например, с помощью осмотического шока или быстрого многократного замораживания и оттаивания), (но обычно многие клетки остаются неповрежденными);

-механическими (высокоэффективный метод)

обработкой ультразвуком (клетки разрушаются под действием гидродинамических сил), (при малых объемах);

с помощью шаровой мельницы (при больших объемах используют), (Большинство клеток разрушается под действием сдвиговых напряжений, возникающих в результате быстрого движения шариков);

гомогенизации под давлением (концентрированную клеточную суспензию продавливают через небольшое отверстие под высоким давлением, а затем давление резко сбрасывают, происходит лизис);

соударения (клеточную суспензию большой вязкости направляют под давлением на неподвижную поверхность или навстречу потоку другой суспензии).

21. Какие существуют виды хроматографии по механизму разделения веществ? Каковы особенности каждого вида?

-Распределительная – распределение в неподвижных жидких фазах (экстракция)

-Ионообменная – на разной способности веществ к ионному обмену

-Адсорбционная – основана на различии в адсорбируемости веществ твердым сорбентом

-Эксклюзионная (молекулярно-ситовая) – на различии в размерах и формах молекул разделяемых веществ

-Аффинная - на специфических взаимодействиях, характерных для некоторых биологических и биохимических процессов (например, антитело и антиген, гормон и рецептор и др.).

-Осадочная – основанная на образовании отличающихся по растворимости осадков разделяемых веществ с сорбентом

22. Как происходит разделение веществ при ионообменной и аффинной хроматографиях?

Ионообменная хроматография позволяет разделить молекулы, основываясь на ионных взаимодействиях. Неподвижная фаза имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда. Этот вариант хроматографии классифицируется на два типа — катионную и анионную ионообменную хроматографию. Суть в том, что только положительно заряженные белки проходят сквозь колонку, а остальные остаются в ней. При изменении pH среды меняются заряды, и исходя из заряда выходят разные белки в зависимости от их суммарного заряда (аминокислотного).

Аффинная хроматография — разновидность лигандной хроматографии. В основе последней лежит реакция взаимодействия разделяемых примесей с лигандом, связанным с инертным носителем. В случае аффинной хроматографии в роли примесей выступают биологически активные вещества (белки, ферменты), вступающие с лигандом (тоже, как правило, органическим) в специфическое биохимическое взаимодействие. Например: антитело-антиген, гормон-рецептор, фермент-субстрат, гуанин-цитозин и тд.. Именно высокая специфичность подобного взаимодействия обусловливает высокую эффективность аффинной хроматографии и её широкое (по сравнению с другими видами лигандной хроматографии) распространение. Суть в том, что она использует структурные особенности белков для разделения. Преимущества – высокая степень очистки, недостатки – загрязнение лигандом.

23. Какие вещества мешают определению концентрации белка колориметрическими методами и каким образом можно от них избавиться?

Спектрофотометрический метод основан на способности ароматических аминокислот (триптофана, тирозина и фенилаланина) поглощать ультрафиолетовый свет со средним максимумом поглощения при 280 нм. Таким образом, измерив величину оптической плотности при этой длине волны и используя коэффициент экстинкции для данного белка, можно рассчитать его количество.

Коэффициент молярной экстинкции является характеристикой того, насколько сильно вещество поглощает свет на заданной длине волны. Он может быть использован для определения концентрации белка в растворе при помощи спектрофотометра.

Коэффициент экстинкции белка на длине волны 280 нм зависит исключительно от числа остатков ароматических аминокислот, в частности, триптофана, и потому может быть предсказан исходя из аминокислотной последовательности.Для определения белка методом Лоури мешают примеси мочевины, меркаптоэтанола и аминов. Для измерения концентрации апобелков необходимо предварительно перевести его в раствор, не содержащие этих примесей с помощью гель-фильтрации (обессоливания).

Для того, чтобы нивелировать влияние не поглощающих в диапазоне измерения примесей, используют кювету сравнения, в которой присутствует растворитель, но отсутствует белок. Если используются колориметрические методы, то в контрольный образец вносится растворитель без белка в таком же объеме, как и в опытные и калибровочные образцы вносятся соответствующие растворы белка. Величину поглощения в кювете сравнения вычитают из величины поглощения опытного образца. Если в измеряемом растворе присутствуют детергенты (мочевина, гуанидин), то от них избавляются путем предварительного обессоливания образцов. Некоторые коммерческие наборы для определения концентрации белка содержат дополнительные добавки для нейтрализации небольших количеств детергента.

24. Опишите принцип определения концентрации белка по Лоури.

Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью. Ha развитие окраски влияет большое количество веществ: компоненты буферных систем (трис-буфер), восстановители (цистеин, дитиотреитол, аскорбиновая кислота), комплексоны (ЭДТА), детергенты (тритон X100 вызывает выпадение осадка), сернокислый аммоний и др. В связи с этим при построении калибровочного графика для определения белка по методу Лоури в растворитель для стандартного белка необходимо включать все компоненты, содержащиеся в анализируемых пробах. Осаждение белков из растворов, или очистка белковых растворов от низкомолекуляриых компонентов путем диализа или гель-фильтрации. Интенсивность окраски комплекса, которая пропорциональна количеству белка в исследуемой пробе, измеряется спектрофотометрически.

25. Какими способами осуществляют денатурацию белков при проведении электрофореза?

Когда требуется фракционировать белки исключительно по молекулярной массе, применяют ПААГ-электрофорез (эф в полиакриламидном геле) в денатурирующих условиях. Этот метод позволяет оценить количество полипептидов в белковой смеси, при его использовании достигается очень четкое разделение зон, но активность ферментов полностью или в значительной мере может быть утрачена из-за их денатурации. Денатурирующие условия создаются путем обработки пробы избытком додецилсульфата натрия (ДСН).

ДСН также сообщает полипептидным цепочкам вне зависимости от их аминокислотного состава сильный отрицательный заряд, что позволяет разделять молекулы только по массе.

Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле используется для оценки качества белков. Перед нанесением на гель белки подвергают диссоциации нагреванием с сильным анионным детергентом — натрия додецилсульфатом (ДСН). Денатурированные полипептиды связываются с ДСН и принимают вид стержня, несущего сильноотрицательный заряд. Величина этого заряда зависит только от величины молекулы белка. ДСН-полипептидные комплексы мигрируют в геле со скоростью, зависящей от размера полипептида. Миграция этих комплексов происходит в направлении к аноду, при этом комплексы с низкими молекулярными массами движутся быстрее, чем с большими молекулярными массами. С помощью смеси стандартных белков известной молекулярной массы определяют зависимость подвижности молекул от их молекулярной массы, а наличие единичной полосы в геле является критерием чистоты белка.