Генети́ческая трансформа́ция — изменение наследственных свойств клетки в результате внесения в нее генетической информации при помощи чужеродной изолированной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Трансформация приводит к появлению у трансформированной клетки (трансформанта) и ее потомства новых признаков, характерных для объекта — источника ДНК.
В 1928 году превращения непатогенных штаммов вирусов Streptococcus pneumoniae в патогенные штаммы, в результате взаимодействия с убитыми клетками патогенных штаммов. В 1944 году трансформацию обеспечивают молекулы ДНК, которые являются носителями наследственной информации.
Компетентная клетка – это те клетки, которые способны поглощать извне чужеродную ДНК. Например, состояние бактерии, при котором она может включать в себя экзогенные молекулы ДНК, т. е. быть реципиентом ДНК при трансфекции.
Компетентные клетки у различных видов бактерий отличаются от некомпетентных не только способностью к поглощению ДНК, но и другими свойствами:
• сниженным уровнем метаболизма;
• устойчивы к пенициллину, чем остальные клетки в популяции;
• сниженным темпом репликации ДНК или вообще ее отсутствием;
• меньшими размерами;
•изменением наружных слоев, наличием обнаженных участков цитоплазматической мембраны;
• повышенной чувствительностью к осмотическому шоку, тепловой
обработке;
• сниженным поверхностным зарядом.
Компетентные клетки широко используются в генной инженерии в качестве реципиентов векторных плазмид.
Клетки E. coli не обладают природной компетентностью. Однако ввиду важности этого организма для молекулярной генетики, были разработаны методы, придающие E. coli искусственную компетентность. В настоящее время установлено, что при низких температурах в присутствии двухвалентных катионов экзогенная ДНК может с высокой эффективностью проникать внутрь клеток E. coli.
bla (Amp)- Селективный маркер (ген устойчивости к антибиотику ампициллину, данный ген обеспечивает негативную селекцию нетрансформированных клонов. Клетки, не содержащие плазмидную конструкцию, не способны расти на среде с ампициллином и погибают.)
ori- Ориджин репликации
araC – участок специальной генетической регуляции арабинозный оперон, позволяющий контролировать экспрессию флуоресцентного белка (присутствие арабинозы увеличивает экспрессию) – araC регуляторные
GFP – ген, кодирующий флуоресцентный белок
Оперон — это группа генов прокариот, находящихся под общим промотором. Все эти гены транскрибируются на одну общую молекулу мРНК.
В присутствии глюкозы – репрессора, оперон выключен. В присутствии арабинозы araC активирует транскрипцию оперона.
Гены araA, araB, araD структурные – кодируют синтез ферментов, образуют оперон araBAD. AraC кодирует регуляторный белок araC, имеющий центр связывания с арабинозой.
CAP (catabolism activating protein)-белок в комплексе с цАМФ связывается опероном в области промотора, активируя его экспрессию в случае нехватки глюкозы.
Регуляция белком araC.
Регуляторный белок araC, имеющий центр связывания с арабинозой. AraC осуществляет негативную и позитивную регуляцию.
В отсутствие арабинозы araC связывается с участками ДНК и образует петлю, препятствуя транскрипции. Связываясь с арабинозой, регуляторный белок становится активатором транскрипции araBAD-оперона.
По механизму «негативной регуляции»: Белок-репрессор соединяется с оператором и блокирует транскрипцию, так как препятствует перемещению РНК-полимеразы. Весь оперон оказывается «выключен».
При наличии в среде индуктора (арабинозы) он взаимодействует с белком-репрессором, в результате чего репрессор не может присоединиться к оператору. Свободный оператор «открывает путь» РНК-полимеразе, и все гены оперона транскрибируются. При удалении индуктора репрессор вновь занимает место на операторе, и транскрипция прекращается.
Применяют для отбора трансформированных клеток, содержащих экспрессионную плазмиду, и для поддержания стабильности плазмидной ДНК во время культивирования. В первом случае важно идентифицировать клетки, содержащие плазмиды с целевым геном, и отделить их от нетрансформированных клеток и клеток, несущих «пустую» плазмиду.
Маркером может служить устойчивость к антибиотикам. Клетки, не содержащие плазмидную конструкцию, не способны расти на среде с антибиотиками и погибают. Этот метод позволяет эффективно отделить трансформированные клетки от нетрансформированных, но не позволяет отделить клетки, несущие плазмиду с целевым геном, от клеток с «пустой» плазмидой.
Антибиотик добавляют для того, чтобы исключить рост не трансформированных клеток. Трансформированные клетки имеют устойчивость к антибиотику из-за гена, кодирующего В-лактамазу, которая обеспечивает устойчивость к ампициллину. Арабиноза действует как индуктор, нужна для активации арабинозного оперона, который контролирует экспрессию белка в клетке. Признаки: наличие посторонних колоний.
Эфф. трансф. = число колоний на чашке / кол-во ДНК на чашку (мкг)
Эффективность трансформации зависит от состояния клеток, от качества плазмидной ДНК, ее снижают субъективные ошибки экспериментатора (перемешивание, heat shock, пипетирование, высев клеток на чашку, перегрев клеток). Максимальная эффективность трансформации достигается качеством работы.
Происхождение большинства лабораторных и промышленных штаммов E. coli восходит к штамму линии K-12 или к штамму линии B. Особенностью этих штаммов является наличие мутаций, которые обеспечивают высокий выход и качество экспрессируемых плазмид.
Использование этого вида бактерий связано с тем, что E. coli – один из наиболее изученных организмов. Получена исчерпывающая информация о его генетике, биохимии, физиологии, разработаны хорошие системы векторов для экспрессии чужеродной информации в клетках этого вида бактерий, подобраны питательные среды и условия культивирования.
Рекомбинантные белки - результат новых комбинаций генов, которые формируют ДНК. Рекомбинантные белки получены на основе клонированных последовательностей ДНК, которые обычно кодируют ферменты и белки с известными функциями.
Рекомбинантные белки — это белки, ДНК которых была создана искусственно.
Технологии рекомбинантных ДНК – это совокупность процедур, позволяющих осуществить конструирование нового генного комплекса и перенос его в организм-реципиент, где новый генетический материал начинает работать.
1. Получение нужной последовательности – синтез ДНК методом ПЦР
2. После обработки рестриктазами полученный ген соединяют (лигируют) с клонирующим вектором с образованием новой, рекомбинантной молекулы – конструкция «клонирующий вектор – встроенная ДНК». Вектор для клонирования – молекула ДНК, способная к включению чужеродной ДНК и к автономной репликации, служит инструментом для введения генетической информации в клетку. То есть является молекулой-носителем для клонируемой ДНК.
3. Полученную рекомбинантную конструкцию вводят в клетку-мишень, где она реплицируется и передается потомкам. В зависимости от типа вектора и схемы эксперимента рекомбинантная ДНК может либо реплицироваться автономно, либо встроиться в хромосому клетки-хозяина.
4. Используя селективный маркер, идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК. (высев клеток на среду с антибиотиком)
5. Наращивание бактериальной массы
Локализация целевого белка |
Достоинства |
Недостатки |
Секретироваться в культуральную среду (при наличии в экспрессионной конструкции лидерного пептида) |
Нет загрязнения клеточными белками, отсутствие клеточных протеаз |
Низкая концентрация целевого белка, большой объем культуры, требующий концентрирования |
Секретироваться в периплазму (при наличии в экспрессионной конструкции лидерного пептида) |
Небольшое количество балластных белков, правильный фолдинг целевого белка |
Маленькое количество целевого белка из-за ограниченного пространства |
Накапливаться в цитоплазме клетки-хозяина в растворимой форме |
Правильный фолдинг целевого белка, нет необходимости переводить белок в растворимую форму |
Наличие клеточных протеаз, большое количество балластных белков, трудности очистки |
Накапливаться в цитоплазме клетки-хозяина в виде нерастворимых телец включения |
Высокая чистота препарата, легкость очистки целевого белка |
Сложности фолдинга целевого белка, необходимость перевода белка в растворимую форму |
Промотор бактериофага Т7 является сильным промотором и обеспечивает очень высокий уровень транскрипции целевых генов. Для транскрипции гена под контролем Т7 необходима РНК полимераза бактериофага T7. Данный фермент очень активен и высоко специфичен к последовательности промотора бактериофага T7. Транскрипция гена в плазмиде под управлением T7 промотора может быть запущена после синтеза T7 полимеразы ген, который встроенной в геном штамма-продуцента в виде профага (λDE3). Ген полимеразы, в свою очередь, может находиться под управлением индуцируемого промотора, такого как lac. T7 промоторы используются во многих коммерческих экспрессионных системах и включается при добавлении ИПТГ.
Клетки штамма E. coli BL21(DE3), культивировали в LB-среде, содержащей ампициллин с постоянным перемешиванием при 37°С до плотности OD590нм = 0,8. Индукцию синтеза белка проводили добавлением в культуральную среду ИПТГ (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид), и культивировали еще в течение 3-х часов в тех же условиях. Клетки осаждали центрифугированием (5000g, 20 мин, 4°С).
Экспрессия белков в растворимой форме дешевле, быстрее, так как нет проблем с фолдингом и с дополнительным растворением белка, как в случае с тельцами включения. Недостатки– нестабильность (доступность для протеаз), сложность очистки (так как есть риск повредить белок растворителем).
Регулировать экспрессию белка необходимо поскольку, экспрессия чужеродного белка может привести к гибели бактерии-хозяина, к тому же плазмиды могут утрачиваться после нескольких клеточных циклов. Экспрессия белка – это синтез белков в клетке, под контролем определенных генов. Длинный процесс с транскрипцией ДНК, получением РНК и преобразованием его в активный белок.
В биотехнологических экспрессионных системах регуляция экспрессии нужна для оптимизации роста культуры клеток с целью получения максимального количества целевого белка. В частности, бактериальные клетки в культуре без экспрессионной нагрузки демонстрируют логарифмический характер роста. Индукцию экспрессии рекомбинантного белка начинают в средней фазе роста, когда оптическая плотность клеточной культуры достигает OD600 ~ 0.6-0.7 оптических единиц. После добавления индуктора запускается процесс синтеза целевого белка, а деление клеток при этом замедляется, постепенно выходя в стационарную фазу. Если индуктор добавлять сразу, то клеток в культуре будет мало, что снизит выход белка, если же добавить в позднюю фазу роста, то при большом количестве клеток белка будет мало, так как ресурсы питательной среды уже будут истощены и их будет недостаточно для синтеза.
Для этого используются сильные регулируемые промоторы: промоторы lac- и trp-оперонов E. соli; специально сконструированный tac-промотор, включающий — 10-область lас-промотора и — 35-область trp-промотора; промотор бактериофага λ; промотор гена бактериофага Т7. С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции генов. Так, lac-оперон в отсутствии лактозы находится в репрессируемом состоянии. Включение lac-оперона или происходит при добавлении в среду лактозы или ИПТГ, т.е. возобновляется транскрипция.
Ну и еще можно упомянуть арабинозный промотор, с которым мы, собственно, и работали.
ИПТГ – изопропил-β-D-тиогалактопиранозид – индуктор lac-оперона, который контролирует процесс транскрипции. В технологии рекомбинантных ДНК используется для индукции клонированных генов.
ИПТГ предотвращает связывание белка-репрессора с lac-опероном, что возобновляет транскрипцию, и как следствие запускает синтез нужного белка.