Наиболее выраженные изменения происходили в кишечнике крыс, получавших ежедневную дозу в 100 личинок анизакид. Слизистая оболочка отечна, эпителий верхушек ворсинок десквамирован. В строме - диффузные скопления зрелых лимфоцитов и плазмоцитов, а также довольно большого количества эозинофилов. В подслизистом слое выражен отек, полнокровие сосудов, явления плазморрагии. Данные изменения соответствуют катаральному энтериту с аллергическим компонентом.
При гистологическом исследовании соответствующих органов контрольных животных подобных изменений не отмечали. Таким образом, нежизнеспособные личинки рода Anisakis и продукты их жизнедеятельности, сохраняющиеся в свежемороженой рыбе, вызывают в кишечнике лабораторных животных развитие катарального аллергического энтерита.
При попадании в тонкий кишечник соматические и экскреторно-секреторные продукты нежизнеспособных личинок частично подвергаются перевариванию до отдельных аминокислот, однако при развитии энтерита и десквамации эпителиальных клеток процесс переваривания становится невозможен, в связи с чем данные продукты нематод всасываются в кровь и разносятся по организму. Одним из основных органов, отвечающих за процессы детоксикации, является печень, которая первая реагирует на воздействие паразитов. Уже при дозе в 5 личинок в печени регистрировали в разных отделах долек и перипортально одиночные зрелые лимфоциты. При сохранении дольковой структуры обнаруживали умеренно выраженную белковую дистрофию гепатоцитов. Синусоиды бедны кровью, вены расширены, неравномерного наполнения.
Увеличение дозы личинок постепенно привело к выраженной белковой дистрофии гепатоцитов, формированию сначала мелких, затем более крупных скоплений лимфоцитов. Также отмечались изменения со стороны сосудистого русла в виде расширения вен. Характерной особенностью воздействия продуктов личинок анизакид явилось и то, что гепатоциты имели 1-2 ядрышка и крупные ядра с глыбчатым распределением хроматина. При дозе в 100 личинок наблюдали гиалиново-капельную или гидропическую дистрофию гепатоцитов. Также выявляли гигантские многоядерные клетки. Дифференциальная окраска виментином, который специфически окрашивает гепатоциты, и S-100, окрашивающим гистиоцитарные элементы, позволила определить их как многоядерные гистиоциты.
В селезенке отмечали полнокровие красной пульпы, крупные клеточные фолликулы. Субкапсулярно и перифолликулярно обнаруживали скопления многоядерных гистиоцитов, которые с увеличением дозы введенных личинок постепенно увеличивались. Таким образом, соматические и метаболические продукты личинок Anisakis simplex, являясь сильными антигенами, вызывают пролиферацию клеток ретикуло-эндотелиальной системы в печени и селезенке лабораторных животных.
При исследовании тканей семенников отмечали относительное сохранение структуры органа, незначительный отек и полнокровие сосудов стромы. Сперматогенез был выражен слабо в разных канальцах, хвостовые отделы сперматозоидов часто были в состоянии агглютинации. Уже при дозе 5-10 личинок наблюдали частичную дистрофию и десквамацию сперматогенного эпителия. При дозе в 50 личинок эпителий семявыносящих протоков имел признаки атрофии, сами протоки - кистозно расширены.
У крыс, получавших мясо рыбы в разной степени инвазированной личинками анизакид выраженных изменений в клеточном и биохимическом составе крови не наблюдали. Однако по истечении срока эксперимента в различных органах данных животных отмечали характерные гистопатологические изменения. При скармливании рыбного фарша патологические изменения тканей тонкого кишечника также присутствовали, причем степень выраженности патогистологических изменений соответствовала степени инвазированности рыбы личинками анизакид. Если при скармливании фарша, приготовленного из путассу, содержащей менее 10 личинок, обнаруживали лишь отек слизистой оболочки и подслизистого слоя с наличием в апикальных отделах ворсинок одиночных зрелых лимфоцитов или их мелких групп, то зараженность рыбы 10-50 личинками вызывала уже и увеличение количества бокаловидных клеток и формирование в строме слизистой оболочки и подслизистого слоя полиморфных клеточных инфильтратов с примесью значительной доли эозинофилов. Наиболее высокая зараженность рыбы (более 50 личинок) вызывала изменения, соответствующие катаральному энтериту с десквамацией эпителия апикальной части ворсинок, формированием диффузных инфильтратов из лимфоцитов, плазмоцитов и эозинофилов. В строме стенки желудка также были обнаружены одиночные зрелые лимфоциты - клетки иммунной системы.
Печень как основной орган детоксикации пищеварительной системы также реагировала появлением в разных отделах долек и портальных трактах при слабой степени инвазии рыбы - единичных лимфоцитов, при увеличении интенсивности инвазии - мелких групп лимфоцитов и макрофагов. Также присутствовали признаки дисциркуляторных изменений в виде переполнения кровью и расширения венозных сосудов. При дозе до 50 экз. в гепатоцитах выявляли гидропическую, более 50 - гиалиново-капельную и вакуольную дистрофию и наличие мелких жировых вакуолей.
В красной пульпе селезенки выявляли полнокровие, под капсулой и вокруг фолликулов располагались отдельные гистиоциты с крупными ядрами. В центральных отделах долек была заметна макрофагальная реакция. При ИИ рыбы более 50 личинок в селезенке крыс отмечали густые скопления зрелых лимфоцитов.
Некоторые изменения происходили и в семенниках животных. При сохранении сперматогенеза отмечались его неравномерность в различных канальцах, десквамацию клеток в просветы, дистрофические изменения. Сперматозоиды зачастую имели слабоокрашенные ядра. С увеличением степени зараженности рыбы сперматогенез был угнетен, отдельные канальцы оказывались полностью запустевшими.
Таким образом, всасывающиеся из кишечника белковые продукты личинок Anisakis оказывают токсическое действие, проявляющееся пролиферативными изменениями в органах ретикуло-эндотелиальной системы, а также угнетением сперматогенеза. Интенсивность данных изменений напрямую зависит от интенсивности поражения рыбы личинками.
Морфологические изменения в органах крыс после скармливания обработанной в микроволновой печи, а также вареной инвазированной рыбы также присутствовали, однако были менее выраженными, нежели в группе животных, получавших свежемороженую рыбу. Так в семенниках сперматогенез оставался относительно сохраненным, с незначительными признаками дистрофии. В печени обнаруживали некоторые дисциркуляторные изменения, наличие одиночных зрелых лимфоцитов. Более выраженные изменения наблюдали в селезенке в виде полнокровия красной пульпы, активации Т и В-зависимых зон и клеток гистиоцитарного ряда. В стенке кишечника на фоне отека и инфильтрации клетками лимфоплазмоцитарного ряда установили увеличение количества эпителиоцитов в состоянии митоза, которое свидетельствует о процессах активного восстановления органа. В кишечной стенке присутствовали также и эозинофилы, но несколько в меньшем количестве по сравнению с использованием свежемороженой рыбы. Следовательно, кулинарная термическая обработка не исключает развития иммунологических и аллергических реакций при скармливании животным инвазированной личинками анизакид рыбы.
2.2.10. Эмбриотоксическое действие личинок агнизакид при экспериментальном пероральном введении лабораторным животным
Во время проведения эксперимента общее состояние опытных животных оставалось удовлетворительным. Количество эозинофилов крови крыс перед началом проведения опыта колебалось в пределах 0-2%, что соответствует физиологической норме. Через три дня после инокуляции личинок изменений в клеточном составе крови не отмечали. Через пять дней количество эозинофилов увеличилось до 3-4%, однако к 10 дню вернулось к исходной точке. Что касается крыс первой группы, а также контроля, то у них уровень эозинофилов не превышал нормы на всем протяжении опыта.
При инокуляции самкам крыс нежизнеспособных личинок во всех использованных дозах в 1-2 дни беременности отмечали 100%-ную эмбриональную смертность. При гистологическом исследовании в яичниках животных обнаруживали желтые тела, иногда кистозно измененные, в матке - отек тканей и образование кист дна измененных маточных желез. Количество желтых тел было значительно меньше (3-4) по сравнению с контролем (8-9).
Пероральное введение личинок анизакид на 7-8 и 13-14 сутки беременности вызывало изменения в состоянии половых желез, а также плодов и плацент. При однократном введении личинок в сроки 13-14 дней в яичниках отмечали множественное образование кист. В плаценте отмечали более интенсивные изменения: цитоплазма децидуальных клеток имела ярко выраженную эозинофильную зернистость, полиморфные, местами уродливой формы, гиперхромные ядра иногда с наличием 1-2 ядрышек, отмечались острые нарушения фето-плацентарного кровообращения.
Кроме этого, отмечали значительное уменьшение размеров плода и плаценты, напрямую зависящее от дозы введенных личинок анизакид, на фоне высокого показателя постимплантационной смертности. При исследовании органов плодов отмечали нарушения микроциркуляции крови в органах.
2.2.11. Иммунохимический анализ соматического экстракта A.simplex
Соматические экстракты гельминтов разных видов не однородны по антигенному составу и являются многокомпонентными системами. Установлено, что разные виды гельминтов могут иметь общие антигенные компоненты, которые затрудняют специфическую диагностику. Для определения антигенного состава различных продуктов гельминтов и выявления наличия в них идентичных компонентов используется реакция иммунодиффузии (РИД).
В результате проведения РИД мы установили, что полученные нами экстракты личинок анизакид (АГ1 и АГ2) являются антигенами, способными вызывать преципитацию с гипериммунными сыворотками кроликов. Все три пробы сыворотки иммунизированных животных оказались достаточно активными как в нативном состоянии, так и в разведении 1/1. Тем не менее, сыворотка крови одного животного реагировала с гомологичными антигенами в разведении 1/8, что свидетельствует об индивидуальном активном иммунном ответе данной особи.
В белковом спектре экстракта АГ1 выявляли в агаровом геле три преципитирующих комплекса, из которых средний был представлен четкой полосой, а крайние два проявлялись в виде слабых полос.
В экстракте из анизакид АГ2 в гомологичной системе реакции установили наличие 1-2 полос преципитации, из которых одна была четко выраженной и идентичной средней полосе АГ1. Таким образом, не менее двух белковых компонентов в этом экстракте были антигеноактивными и вызывали синтез антител.
Постановка реакции с использованием сывороток кроликов, иммунизированных антигенами анизакид, и экстракта, приготовленного из токсокар, дала отрицательный результат.
Таким образом, проведенный иммунохимический анализ белкового экстракта из личинок анизакид позволил выявить наличие в его составе не менее трех антигенных компонентов, способных вызывать иммунный ответ у кроликов. Также мы можем предположить, что в составе соматического антигена A.simplex имеется как минимум два компонента, имеющих диагностическое значение в дифференциальной диагностике анизакидоза и токсокароза.
РИД с антигенами анизакид, обработанными кипячением или с помощью СВЧ, также показала положительный результат. В агаровом геле выявляли наличие как минимум одной диффузной полосы, идентичной центральным четко выраженным линиям АГ1 и АГ2. Таким образом, термическая обработка не препятствует проявлению антигенных свойств соматического экстракта А.simplex.
При проведении РИД с использованием в качестве антигена жидкости, полученной при размораживании мышечной ткани инвазированной анизакидами путассу, и гипериммунными сыворотками кроликов также выявили наличие одной четкой полосы преципитации, идентичной центральным линиям АГ1 и АГ2. Данный результат подтверждает возможность попадания соматических и экскреторно-секреторных продуктов гельминтов в мышечную ткань рыбы, особенно при многократном замораживании и оттаивании, которое, в свою очередь, может вызывать патологические изменения желудочно-кишечного тракта при продолжительном употреблении данного продукта.
Выводы
1. На территории города Перми широко распространены гельминтозы и протозоозы домашних плотоядных животных. Собаки заражены на 31,66%, кошки - на 36,47%. Наибольшее количество инвазированных животных относится к безнадзорным и содержащимся в приютах. Наименее инвазированы гельминтами и простейшими служебные собаки.
2. Антитела к антигенам Тoxoplasma gondii выявили у 23,0% служебных собак, 45,5% - собак, содержащихся в муниципальном приюте, 70,2%. - собак, принадлежащих частным лицам. У кошек антитела против токсоплазм обнаружили в 80% случаев, при этом среди животных, имеющих доступ на улицу, - 100%, не имеющих - 34,0%.
3. По результатам серологического обследования сыворотки крови собак г. Перми у 22,29% животных обнаружили антитела к антигенам Lamblia intestinalis. Установлено, что носителями лямблий в городской популяции являются 15% - служебных и 26,67% домашних собак. Выделение цист возбудителя регистрировали у 0,28% домашних собак.